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Projekt
µ Proteine in Haloferax volcanii: ein bedeutsamer Teil des Proteoms
Antragstellerin
Professorin Dr. Anita Marchfelder
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung
Förderung von 2017 bis 2022
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 379070156
Neueste Publikationen zeigen, dass Proteine, die kürzer als 50 Aminosäuren sind (hier µ Proteine genannt), in der Zelle synthetisiert werden und wichtige Funktionen in der bakteriellen sowie der eukaryotischen Zelle übernehmen. Über die Funktion dieser Proteine in Archaeen ist sehr wenig bekannt. Deshalb wollen wir in dem geplanten Projekt zwei Schwerpunkte bearbeiten: (1) die Identifizierung des kompletten µ Proteoms des halophilen Archaeons Haloferax volcanii und (2) die Untersuchung schon identifizierter ausgewählter µ Proteine. Wir haben in den Vorarbeiten zu diesem Projekt schon mit der Identifizierung des µ Proteoms begonnen. Proteine wurden aus Zellen, die bei Standardbedingungen und zwei Stressbedingungen angezogen wurden, isoliert und mit Massenspektrometrie identifiziert. Mit dieser Methode konnten wir 34 µ Proteine identifizieren, davon haben wir zunächst vier µ Proteine für weitere eingehende Analysen ausgesucht. Für drei der vier µ Protein-Gene konnten wir Deletionsstämme herstellen, ein Gen konnten wir nicht deletieren, dessen Expression haben wir deshalb mit CRISPRi herunterreguliert. Die ersten Analysen dieser vier Deletions- bzw. CRISPRi-Stämme haben für alle interessante Phänotypen gezeigt. Zusammengefasst zeigen unsere Vorarbeiten, das es in Haloferax µ Proteine gibt, und die ersten Untersuchungsergebnisse für die vier ausgesuchten µ Proteine deuten daraufhin, dass sie auch wichtige zelluläre Aufgaben übernehmen. In dem beantragten Projekt werden wir im Rahmen des Z1 Projekts die Identifizierung des kompletten µ Proteoms von Haloferax vollenden, indem wir Isolierungs-Bedingungen benutzen, die für die Identifizierung von µ Proteinen optimiert sind. Um alle bestimmten Massen auch den entsprechenden Gene im Haloferax Genom zuordnen zu können, werden wir im Rahmen des Z2 Projektes mithilfe von bioinformatischen Methoden das Haloferax Genom re-annotieren. Weiterhin werden wir zur vollständigen Identifizierung des µ Proteoms Ribosome-Profiling durchführen (im Rahmen des Z2 Projektes). Die in den Vorarbeiten begonnen Untersuchungen zu den vier ausgewählten µ Proteinen werden fortgesetzt, um ihre biologische Funktion zu bestimmen. Die Deletions- bzw. CRISPRi-Stämme werden eingehend untersucht, und wir werden den Effekt der Überexpression der µ Protein auf die Zelle untersuchen. Auch werden wir die Interaktionspartner mithilfe von FLAG-Fusionsproteinen identifizieren. Wir werden ihre zelluläre Lokalisation sowie ihre Struktur bestimmen. Als weitere Kandidaten für die Untersuchung von µ Proteinen werden wir solche untersuchen, die von kleinen regulatorischen RNAs kodiert werden. Wir konnten zwei sRNAs identifizieren, die potentiell µ Proteine kodieren. Für beide sRNA Gene konnten wir Deletionsstämme herstellen, die im vorgeschlagenen Projekt weiter untersucht werden sollen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
