Determination of protein associations within the human inner kinetochore in living cells using Acceptor Bleaching FRET and FLIM
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Am Zentromer bildet sich ein Multiprotein-Komplex aus, das „Kinetochor“, der in der Mitose die Verbindung vom Chromatin zu den Mikrotubuli herstellt. Der korrekte Aufbau und die Funktion dieses Komplexes wird durch Proteine des mitotischen Checkpoints kontrolliert. Eine Fehlfunktion des Kinetochors kann zu Aneuploidie und Krebs führen. Im geförderten Projekt haben wir für viele Proteine des inneren Kinetochors in lebenden humanen Zellen aufgeklärt, ob sie im Nukleoplasma vor der Bindung ans Zentromer Präkomplexe bilden und mit welcher Dynamik sie wann im Zellzyklus ans Zentromer binden. Im Komplex haben wir mittels in vivo-FRET die molekularen Nachbarschaften der Proteine untereinander bestimmt und, insbesondere aus diesen Daten, die molekulare Architektur des Gesamtkomplexes abgeleitet. Wir fanden, dass das innere Kinetochor eine Brücke bildet zwischen zwei Nukleosomen, von denen das eine die Zentromer-markierende Histon H3-Variante CENP-A und das andere Nukleosom eine andere spezifische H3-Variante enthält. Unsere Daten belegen, dass sich am Zentromer eine definierte Chromatin-Struktur ausbildet, die sich offensichtlich während des Zellzyklus mehrfach ändert. Ob die mit FRET angezeigte unmittelbare Nachbarschaft der Proteine auf einer direkten Protein-Protein-Wechselwirkung beruht, überprüften wir für die meisten der inneren Kinetochor-Proteine mit drei anderen unabhängigen in vivo-Verfahren. Unser experimenteller Ansatz zeigt, dass biophysikalische Protein-Eigenschaften umfassend und konsistent in der lebenden Zelle bestimmt werden können. Für unsere Arbeiten stellten wir eine stets weiter wachsende Zahl von markierten Kinetochor-Proteinen her, bisher circa 5.000.
