Die Entschlüsselung des Poly(ADP-Ribose) Codes: Wie die strukturelle Diversität von Poly(ADP-Ribose) Molekülen zelluläre Funktionen während der genotoxischen Stressantwort beeinflusst

• Antragsteller: Professor Dr. Aswin Mangerich
• Fachliche Zuordnung: Public Health, Gesundheitsbezogene Versorgungsforschung, Sozial- und Arbeitsmedizin ; Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 386775082

Die durch die PARP1 vermittelte post-translationale Poly(ADP-Ribosyl)ierung (PARylierung) ist an diversen zellulären Prozessen beteiligt, z.B. an der DNA Reparatur, Transkription und der Regulierung des Zelltods (Rank et al. Nucleic Acids Res. 2016). Sie trägt hierdurch zu zahlreichen (patho-)physiologischen Zuständen bei. PARP Inhibitoren kommen in der klinischen Krebstherapie zum Einsatz.Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, die biochemischen und zellulären Funktionen in der strukturellen Heterogenität der PAR Moleküle, welche mit variabler Kettenlänge und Verzweigungsgrad auftreten, aufzuklären. Dies beinhaltet die folgenden zentralen Fragen:(i) Welche Rolle spielt Protein-gebundene Mono-ADP-Ribose, welche als Intermediat im PAR Metabolismus auftritt?(ii) Welche Rolle spielt die Heterogenität der PAR Kettenlänge (kurz vs langkettig)?(iii) Welche Rolle spielt die Heterogenität im Verzweigungsgrad von PAR Molekülen?Im Rahmen dessen sollen weiterhin folgende Fragestellungen adressiert werden:- Inwieweit beeinflusst die Struktur der PAR Moleküle deren Stabilität und Abbaukinetik?- Existieren spezifische Reader für die unterschiedlichen PAR Formen, d.h. existiert ein sogenannter PAR Code?- Beeinflusst die strukturelle Diversität der PAR die Komplexbildung und enzymatische Funktion ihrer Zielproteine?- Wie wirkt sich die strukturelle Heterogenität der PAR Moleküle auf bestimmte zelluläre Funktionen aus? Hierzu kommen PARP1 Mutanten mit modifizierten enzymatischen Aktivitäten zum Einsatz. Dies beinhaltet Mutanten mit Mono-ADP-Ribosylierungsaktivität, sowie mit Eigenschaften zur Generierung von PAR Molekülen mit veränderter Kettenlänge und Verzweigungsgrad. Diese Mutanten sollen sowohl auf biochemischer Ebene mittels rekombinanter Proteine als auch in zellulären Modellen mittels transienter PARP1-Rekonstitutierung und CRISPR/Cas-generierten HAP1 Zellen untersucht werden. HAP1 Zellen sind eine humane, haploide Krebszelllinie, welche sich ideal für Genome Editing Ansätze eignen.In systematischen, vergleichenden Studien werden eine Reihe biochemischer und zell-biologischer Endpunkte erfasst, um die Auswirkungen der veränderten PARP1 Aktivitäten während der genotoxischen Stressantwort zu untersuchen. Dies beinhaltet (i) die Analyse des zellulären PAR und NAD+ Metabolismus der einzelnen PARP1 Mutanten, (ii) die Identifizierung der PAR-Struktur-abhängigen Interaktome mittels Affinitäts-Massenspektrometrie, (iii) die orts- und zeitabhängige zelluläre Verteilung ausgewählter Zielproteine mittels moderne Bioimaging Methoden, sowie (iv) die zellulären Konsequenzen der veränderten enzymatischen Aktivitäten während der genotoxischen Stressantwort.Es wird erwartet, hiermit vertiefende Erkenntnisse zur Rolle der PARylierung in der DNA Schadensantwort zu erhalten, welche zu einem besseren Verständnis der PAR-bedingten (Patho-)physiologie beitragen und zur verbesserten Entwicklung pharmakologischer Ansätze in der Krebstherapie führen können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen