Interplay between mononuclear and osteogenic cells during fracture healing in type 2 diabetics
Final Report Abstract
In den letzten drei Jahren ist die Anzahl an Diabetikern (vor allem Typ 2) weltweit stärker als prognostiziert gestiegen. In Deutschland gibt es derzeit knapp 10 Millionen Diabetiker. Bereits bei der Entstehung des Diabetes verändert sich die Qualität der Knochen was, einhergehend mit Beeinträchtigungen im Sehvermögen und Empfinden, ein erhöhtes Frakturrisiko zur Folge hat. Im Falle einer Fraktur gestaltet sich die Behandlung schwierig und es kommt sehr viel häufiger zu Komplikationen als bei stoffwechselgesunden Patienten. Eine Abfrage unseres Krankenhausinformationssystems der letzten 5 Jahre ergab, dass zwischen 14 und 20 % unserer Patienten diagnostizierte Diabetiker sind. Bereits die jüngeren Diabetiker erleiden im Vergleich zu Stoffwechselgesunden, bei vergleichbarem Verletzungsmuster, signifikant schwerere Gewebeschäden. Im Behandlungsverlauf hatten Diabetiker etwa 5-mal mehr Infektionen, ca. 3-mal mehr Osteonekrosen und Osteolysen, sowie etwa doppelt so viele Pseudarthrosen als Stoffwechselgesunde. Basierend auf unserer Hypothese ist die Kommunikation zwischen Monozyten/Makrophagen (PBMCs) und Osteprogenitorzellen bei der Diabetischen Frakturheilung gestört. In dem hier genutzten Setup wurden durch die diabetischen Bedingungen vor allem die Expression und Sekretion von CCL2 und CCL8 in Osteoprogenitorzellen unterdrückt. Beide dienen als starke Chemokine für PBMCs. Die Migration der PBMCs selbst wurde darüber hinaus durch die diabetischen Bedingungen weiter verlangsamt. Durch die von den PBMCs sezernieren Faktoren wurde die Migration und Differenzierung von Osteoprogenitorzellen fördern. In Bezug auf die Migration von PBMCs wurde der Einfluss von TGF-β (transforming growth factor beta) genauer untersucht. TGF-β förderte durch Expression von NOX4 (NADPH Oxidase 4) und der damit verbundenen Aktivierung des FAK (focal adhesion kinase) Signalings die zielgerichtete Migration der Osteoprogenitorzellen. PBMC-konditioniertes Medium förderte auch die Differenzierung von Osteoprogenitorzellen, wie sich in erhöhter ALP (alkalische Phosphatase) Aktivität und Bildung von mineralisierter Matrix zeigte. Dieser Effekt schien Abhängig von der Aktivierung des ERK1/2 Signalings in den Osteoprogenitorzellen. Durch Größenfraktionierung des PBMC Sekrets wurden diese Effekte blockiert. So konnte kein einzelner regulatorischer Faktor identifiziert werden, sondern es musste vielmehr von einer Kombination aus sezernierten Faktoren ausgegangen werden, welche für die beobachteten Effekte verantwortlich sind. Interessanterweise wurde der positive Effekt des PBMC Sekrets durch die diabetischen Bedingungen unterdrückt. Da dies nicht den klinischen Beobachtungen, der häufig erhöhten Knochendichte bei Typ 2 Diabetikern, entspricht wurde zusätzlich der Effekt auf die Osteoklastogenese in einem Co-Kulturmodell untersucht. Die Aktivität von Osteoklasten wurde sowohl in der direkten als auch in der indirekten Co-Kultur durch die diabetischen Bedingungen unterdrückt. Es wurden Unterschiede zwischen der 2D und 3D Co-Kultur herausgearbeitet - 3D Kulturbedingungen waren notwendig, um die erwartet erhöhte Mineralisierung und reduzierte Stabilität der knöchernen Matrix in vitro zu simulieren. Dieses 3D Co-Kulturmodell kann zukünftig auch für andere Versuchsansätze genutzt werden. Aufgrund der pandemiebedingten Einschränkungen in der Gewinnung von Frakturhämatomen wurde für diese Analysen ein in vitro Frakturhämatommodell etabliert. Da dieses aus Patientenblut generiert werden kann, kann dieses zukünftig auch für andere Analysen (z.B. Krankheitsmodelle oder Testung von Medikamenten) genutzt werden. Auch zeigte sich bei unseren Versuchen mehr und mehr, dass die früh in das Frakturhämatom infiltrierenden neutrophilen Granulozyten und deren Aktivierungsstatus einen entscheidenden Einfluss auf die diabetische Frakturheilung haben. In Einklang mit der Literatur, welche eine vermehrte Ausbildung von NETs (neutrophil extracellular traps) in Diabetikern beschreibt, fanden wir erste Hinweise für eine genetische Prädisposition (Polymorphismen des an der NETose beteiligten PADI4 Gens – Nachweismethode wurde etabliert). Dies und die zugrundeliegenden Mechanismen sollen in einem Folgeprojekt genauer untersucht werden (Folgeantrag ist eingereicht).
Publications
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