Entwicklung von Kappen-geschützter mRNA zur optochemischen Kontrolle der Translation in eukaryotischen Zellen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Andrea Rentmeister
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 390706730

• Erstellungsjahr: 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Licht ist ein vielseitiges regulatorisches Werkzeug, da es nicht-invasiv und vollständig orthogonal zu den meisten zellulären Bestandteilen ist. Seine Anwendung kann zeitlich und örtlich in Geweben, Zellen und sogar subzellulären Bereichen kontrolliert werden. Optochemische Ansätze ermöglichen bereits in vielfältiger Weise die Kontrolle der Genexpression auf der Ebene von DNA, mRNA und Proteinen. Eine effiziente Methode zur Induktion der Translation einer exogenen mRNA mit räumlicher und zeitlicher Kontrolle fehlte jedoch zum Zeitpunkt der Antragstellung. Wir haben einen innovativen Ansatz entwickelt, um die Translation von exogener mRNA mit Licht anzuschalten. Hierfür haben wir zunächst eine chemo-enzymatische Route entwickelt, um die 5‘-Kappe mit photospaltbaren Gruppen zu modifizieren und die Interaktion mit Kappenbindenden Proteinen, wie dem Translationsinitiationsfaktor eIF4E zu blockieren. Dies führt in weiterer Folge zur Stilllegung der Translation einer mRNA, die mit einer derart modifizierten 5‘-Kappe versehen ist. Wir haben die hoch promiskuitive N7-Kappen-Methyltransferase Ecm1 verwendet und neue Analoga des Kosubstrats S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) synthetisiert. Außerdem haben wir den enzymatischen Transfer von photospaltbaren Gruppen auf die N2- Position von m7G der 5‘-Kappe mit Hilfe der Methyltransferasevariante GlaTgs-V34A etabliert. Bei dem Versuch die 5‘-Kappe durch Licht-induzierte Abspaltung der Photoschutzgruppen wiederzugewinnen, mussten wir feststellen, dass ortho-Nitrobenzyl (ONB)-Derivate nicht für die Entschützung von N7G geeignet sind und es zu einer Spaltung des Purinrings kommt. Stattdessen entdeckten wir, dass Benzophenon und ein Coumarin-Derivat von der N7-Position des Guanosins mit Hilfe von Licht abgespalten werden können. Für die photogeschützten 5‘-Kappen konnten wir zeigen, dass der co-transkriptionale Einbau in mRNA möglich ist. Wir haben Reporter-mRNAs mit unterschiedlich modifizierten 5‘-Kappen verwendet, um Säugerzelllinien zu transfizieren. In allen Fällen war de Translation der Kappenmodifizierten mRNAs drastisch verringert. Für N2-ONB-kappenmodifizierte mRNA konnten wir zeigen, dass die Licht-induzierte (teilweise) Abspaltung der Photoschutzgruppe zu einem leichten Anstieg der Translation der entsprechenden mRNA führt. Am wichtigsten ist, dass N7- Coumarin-kappenmodifizierte mRNA quasi komplett stillgelegt war. Durch Bestrahlung der Zellen, die mit derart modifzierter mRNA transfiziert worden waren, wurde die Translation effizient eingeschaltet, wie wir anhand der Menge an produziertem Reporterprotein zeigen konnten. Abschließend konnten wir zeigen, dass es durch Kombination von ONB-basierten und Coumarin-basierten photospaltbaren Gruppen möglich ist, die Translation von zwei verschiedenen Reporter-mRNAs in Zellen Wellenlängen-selektiv zu aktivieren.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• A Benzophenone‐Based Photocaging Strategy for the N7 Position of Guanosine. Angewandte Chemie International Edition, 59(8), 3161-3165.
  Anhäuser, Lea; Klöcker, Nils; Muttach, Fabian; Mäsing, Florian; Špaček, Petr; Studer, Armido & Rentmeister, Andrea
  
• Combining Chemical Synthesis and Enzymatic Methylation to Access Short RNAs with Various 5′ Caps. ChemBioChem, 20(13), 1693-1700.
  Muthmann, Nils; Guez, Théo; Vasseur, Jean‐Jacques; Jaffrey, Samie R.; Debart, Françoise & Rentmeister, Andrea
  
• Multiple covalent fluorescence labeling of eukaryotic mRNA at the poly(A) tail enhances translation and can be performed in living cells. Nucleic Acids Research, 47(7), e42-e42.
  Anhäuser, Lea; Hüwel, Sabine; Zobel, Thomas & Rentmeister, Andrea
  
• Engineered SAM Synthetases for Enzymatic Generation of AdoMet Analogs with Photocaging Groups and Reversible DNA Modification in Cascade Reactions. Angewandte Chemie International Edition, 60(1), 480-485.
  Michailidou, Freideriki; Klöcker, Nils; Cornelissen, Nicolas V.; Singh, Rohit K.; Peters, Aileen; Ovcharenko, Anna; Kümmel, Daniel & Rentmeister, Andrea
  
• Tag‐Free Internal RNA Labeling and Photocaging Based on mRNA Methyltransferases. Angewandte Chemie International Edition, 60(8), 4098-4103.
  Ovcharenko, Anna; Weissenboeck, Florian P. & Rentmeister, Andrea
  
• Chemo‐Enzymatic Modification of the 5′ Cap Maintains Translation and Increases Immunogenic Properties of mRNA. Angewandte Chemie International Edition, 60(24), 13280-13286.
  van Dülmen, Melissa; Muthmann, Nils & Rentmeister, Andrea
  
• CAPturAM, a Chemo‐Enzymatic Strategy for Selective Enrichment and Detection of Physiological CAPAM‐Targets. Angewandte Chemie International Edition, 62(4).
  Muthmann, Nils; Albers, Marvin & Rentmeister, Andrea
  
• Enzymatic Modification of the 5’ Cap with Photocleavable ONB‐Derivatives Using GlaTgs V34A. ChemBioChem, 24(2).
  Klöcker, Nils; Anhäuser, Lea & Rentmeister, Andrea
  
• Light‐Activated Translation of Different mRNAs in Cells via Wavelength‐Dependent Photouncaging. Angewandte Chemie International Edition, 62(5).
  Bollu, Amarnath; Klöcker, Nils; Špaček, Petr; P., Weissenboeck Florian; Hüwel, Sabine & Rentmeister, Andrea
  
• Quantification of mRNA cap-modifications by means of LC-QqQ-MS. Methods, 203, 196-206.
  Muthmann, Nils; Špaček, Petr; Reichert, Dennis; van Dülmen, Melissa & Rentmeister, Andrea