Charakterisierung von LeuO und weitern LysR-Typ Transkriptionsregulatoren in Escherichia coli

• Antragstellerin: Professorin Dr. Karin Schnetz
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 392159619

LysR-Typ Transkriptionsregulatoren (LTTRs) bilden die größte Regulator-Familie in Bakterien und sind für die Kontrolle eines breiten Spektrums von Prozessen einschließlich Stressantwort, Metabolismus und Pathogenität bedeutend. LTTRs bestehen aus einer N-terminalen winged helix-turn-helix (wHTH) DNA-Bindedomäne, die durch einen helikalen Linker mit einer C-terminalen Effektor-Bindedomäne (EBD) verbunden ist. LTTRs sind Tetramere mit zwei dimeren wHTH-Linker-Domänen, die DNA spezifisch an zwei benachbarten Stellen binden. Die Bindung eines Effektors induziert eine Konformationsänderung und Verschiebung einer der DNA-Kontakte (sliding dimer mechanism). Hierauf basiert die spezifische Effektor-abhängige Regulation von Zielgenen, die jedoch durch unphysiologisch hohe Expression des LTTRs überkommen werden kann. Der sliding-dimer-Regulationsmechanismus und die Konzentrationsabhängigkeit der Spezifität wurden bisher kaum bei der Analyse pleiotroper LTTRs berücksichtigt. In diesem Vorhaben wird der pleiotrope LTTR LeuO in Escherichia coli, sowie weitere LTTRs, funktionell hinsichtlich der Modulation der Aktivität, des Mechanismus der Transkriptionsregulation, sowie der pleiotropen Rolle charakterisiert werden. LeuO ist als Regulator von über 100 Loci und Antagonist der globalen Nukleoid-assoziierten Repressorproteine H-NS und StpA beschrieben. Es ist jedoch unbekannt wie die LeuO-Aktivität moduliert wird, wie LeuO spezifisch DNA bindet und wie LeuO als Transkriptionsregulator und Antagonist von H-NS und StpA funktioniert. In vorbereitenden Arbeiten haben wir die Kristallstruktur der EBD-Domäne von LeuO gelöst und hyperaktive Mutanten isoliert, die vermutlich in ihrer Aktivität der Effektor-gebundenen Form entsprechen. In diesem Vorhaben ist geplant, die spezifische DNA-Bindung durch Vergleich von wildtypischem LeuO und hyperaktiven LeuO-Mutanten zu charakterisieren. Weiterhin wird das Spektrum der Zielgene mittels ChIP-seq und RNA-seq Analysen einer hyperaktiven LeuO-Mutante validiert werden. Für eine Struktur-Funktions-Analyse soll die Kristallstruktur von LeuO gelöst und durch Mutagenese sowie genetische-biochemische Ansätze die Struktur-Funktions-Beziehung etabliert werden. Durch Austausch bestimmter Aminosäurereste durch unnatürliche crosslinkbare Aminosäuren sollen Interaktionen (beispielsweise mit RNA-Polymerase oder H-NS bzw. StpA) kartiert werden. Weiterhin, wird der Mechanismus der Transkriptions¬regulation als H-NS und StpA Antagonist in vivo analysiert werden. Hierzu wird LeuO mit repetitiven split-superfolder-gfp Epitopen fusioniert (Fluoreszenz-Signalverstärkung) und die Co-Lokalisation mit H-NS in vivo untersucht. Mit den beiden Ansätzen (Crosslinking und Kolokalisation) soll die Frage beantwortet werden, ob LeuO gleichzeitig mit H-NS eine Ziel-DNA bindet oder ob LeuO mit H-NS um die Bindung kompetiert. Diese Ansätze, die für LeuO etabliert werden, sollen zur Charakterisierung weiterer LTTRs in E. coli eingesetzt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen