Aufklärung der molekularen Grundlagen des SEPT2-assoziierten Tyshchenko-Syndroms
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen dieses Projektes haben wir eine Kohorte von 6 Patienten mit Missense-Mutationen und einem Patienten mit einer Deletion im SEPT2-Gen gesammelt. Alle diese Patienten haben eine leichte mentale Retardierung, eine auffällige Fazies und variable Fehlbildungen, welche Syndaktylien, Gaumenspalten und Gehörgangsfehlbildungen mit Leitungsschwerhörigkeit umfassen. Wir konnten in einem in-vitro Experiment, bei dem mutierte GFP-markierte Septin- Fusionsproteine in HeLa Zellen exprimiert wurden, bei allen diesen Patienten eine Störung in der Bildung von physiologischerweise nicht in der Zelle existierenden Septin 2-Homofilamenten und damit ein gestörtes Bindungsverhalten dieser Septinmutanten nachweisen. Die Störung der Filamentbildung ist nicht auf eine geringere Stabilität oder eine erhöhte Abbaurate des Proteins zurückzuführen, da die HWZ der Proteine sich nicht signifikant vom WT unterschieden. Auch konnte im Rahmen von Immunpräzipitationsuntersuchungen nachgewiesen werden, dass die Filamentbildungsstörung am ehesten nicht auf eine Störung der Bindung über die G-Interface zurück zu führen ist. So zeigten, mit Ausnahme der Mutation Sept2-L280H, alle Mutanten eine normale Sept2-Sept2-Homodimerbildung, welche bei Abwesenheit anderer Septine über die G- Interface erfolgt. Auch die Bindung von Septin 2 an seinen physiologischen Bindungspartner Septin 6, welche laut Literatur ebenfalls über die G-Domäne erfolgt, zeigte sich in der Ko-Immunpräzipitation nicht eingeschränkt. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Störung der Filamentformation über Einschränkung der Bindung der NC-Interface erfolgt. Dies steht im Einklang mit der Lokalisation der Mutationen, welche sich laut Protein-Vorhersageprogramm alle (außer Sept2-L280H) im Bereich der NC- Interface der Septin 2-G-Domäne befinden. Angesichts neuer Erkenntnisse bezüglich der Filamentformation von humanen Septinen würde dies bedeuten, dass nicht etwa die zentrale Dimerbindung im Septinhexa- oder -oktamer, und somit mutmaßlich der initiale Schritt der Septinfilamentbildung, gestört ist. Es bedeutet vielmehr, dass Septinhexa- und -oktamere ungestört gebildet werden können, dass eine vertikale Verknüpfung dieser Filamentfragmente jedoch nicht erfolgen kann. Der Einfluss der SEPT2-Mutationen auf die Bindungskapazität via der NC-Interface ist aktuell Gegenstand weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus konnten wir im Rahmen dieses Projektes zwei shRNAs entwickeln, welche eine KD-Rate von 50% bzw 70% nach 3 Tagen hatten. Dies übertrifft die bislang in der Literatur beschriebenen KD-Raten für Septin 2. Es konnte in der Literatur bereits beschrieben werden, dass KD von Septin 2 zu einer erniedrigten Zellteilungsrate führt. Aufgrund der Klinik unserer Patienten gehen wir davon aus, dass bei ihnen kein Zellteilungsdefekt vorliegt, die Missensemutation in Septin 2 also keinen Protein-KD verursachen. Die shRNAs werden aktuell genutzt um im Rahmen von durchflusszytometrischen Untersuchungen den Einfluss der SEPT2-Patientenmutationen auf die Zellteilungsrate in-vitro zu untersuchen. Des Weiteren konnte im Rahmen dieses Projektes gezeigt werden, dass sich die meisten Septine während des Axonwachstums im Bereich der axonalen Wachstumsplatte nachweisen lassen. Dies konnte in-vitro mithilfe von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) induzierbaren i3Neuronen nachgewiesen werden. Aktuell untersuchen wir den Einfluss der TS-assoziierten SEPT2-Mutationen auf die Lokalisation von Septinen während des axonalen Wachstums sowie auf die axonale Wachstumsrate und Axonlänge.
