(Glyko)proteomische Veränderungen während der Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten

• Antragsteller: Professor Dr. Falk Büttner
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394324341

Herzmuskelzellen, die aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) gewonnen wurden, sind medizinisch zur Erprobung neuer Medikamente, als Modelle zur Studie krankheitsrelevanter Mechanismen oder zur Transplantation im Zuge regenerativer Therapien von Interesse. Besonders bei der Transplantation ist der Einsatz klar definierter Kardiomyozyten oder deren Vorläufern von höchster Bedeutung. Als Beispiele seien hier Herzmuskelzellen mit definierten elektrophysiologischen Eigenschaften, wie sie bei atrialen, ventrikulären oder Schrittmacherzellen vorliegen, genannt. Um Kardiomyozyten eines bestimmten Differenzierungszustandes oder elektrophysiologischen Subtyps in ausreichender Zahl herzustellen, sind verbesserte Kultivierungsbedingungen und Verfahren zur Aufreinigung bestimmter Zelltypen erforderlich.Differenzierung von Stammzellen wird maßgeblich durch sezernierte parakrin und/oder autokrin wirkende Proteine und deren Membranrezeptoren gesteuert. Die während der kardiomyogenen Differenzierung relevanten Faktoren und ihre Bedeutung für die Entstehung von bestimmten Herzmuskelzellsubtypen sind nur unzureichend charakterisiert. Deshalb sollen im Rahmen des beantragten Projektes quantitative proteomische Techniken (SILAC, LFQ) genutzt werden, um das secretome und das surfaceome zu verschiedenen Zeitpunkten der Kardiomyozyten-Differenzierung und von verschiedenen Subtypen zu erfassen. Da die Identifizierung sezernierter Proteine durch große Mengen von Serumproteinen wie Albumin erschwert ist, haben wir in Vorarbeiten Protokolle etabliert, die in Abwesenheit von Serum und ohne Zusatz von Albumin differenzierte Herzmuskelzellen in hoher Ausbeute liefern. Zur Analyse des surfaceomes werden wir die Tatsache nutzen, dass Zelloberflächenproteine größtenteils glykosyliert vorliegen. Durch Verwendung eines für unsere Ziele optimierten Biotinylierungsreagenzes, welches spezifisch mit den Glykanen reagiert, können wir Zelloberflächenproteine anreichern, um sie anschließend massenspektrometrisch zu identifizieren und zu quantifizieren. Auch mit aktuellen Differenzierungsprotokollen können keine reinen Herzmuskelzellpopulationen erzeugt werden. Um selektiv Kardiomyozyten eines gewünschten Differenzierungszustandes oder Subtyps anzureichern, sind deshalb neue spezifische Marker erforderlich. Neben Membranproteinen bieten sich N-Glykane als leicht zugängliche Marker an. Wir beabsichtigen daher im Rahmen dieser Studie zusätzlich das N-Glykom definierter Kardiomyozyten Subtypen mittels CGE-LIF zu erfassen. Abschließend soll getestet werden, ob sich mit Antikörpern gegen gefundene Marker (Proteine oder Glykane) eine Anreicherung bestimmter Zellpopulationen oder eine Eliminierung unerwünschter Fraktionen über FACS oder MACS erzielen lässt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen