ERA NANOSCI: Observation and manipulation of individual type I interferon signalling complexes
Final Report Abstract
Die Assemblierung und die Dynamik von Signalkomplexen in der Plasmamembran spielen vermutlich eine wichtige Rolle für die Regulation der Plastizität der Signalvermittlung. Ziel dieses Projekts war es, Oberflächenarchitekturen zu entwickeln, um die Ligand-induzierte Dimerisierung des Typ I Interferonrezeptor als Paradigma eines plastischen Zytokinrezeptors unter kontrollierten Bedingungen in vitro mit Einzelmolekültechniken zu untersuchen. Dieser Rezeptor besteht aus den beiden Untereinheiten IFNAR1 und IFNAR2, welche Interferone (IFN) mit niedriger bzw. hoher Bindungsaffinität binden. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass zelluläre Antworten mit der Bindungsaffinität zu IFNAR1 korrelieren. Um Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen an den isolierten extrazellulären Domänen kraftspektroskopisch untersuchen zu können, wurde zunächst eine neue Immobilisierungstechnik entwickelt, mit welcher die beteiligten Proteine ortspezifisch kovalent über ein kurzes Peptidtag angebunden werden. Diese Technik ermöglichte die Anwendung der Kraftspektroskopie unter definierten strukturellen Bedingungen. Allerdings zeigte es sich, dass die Immobilisierung von IFN zu einer Selbstinhibierung durch Oligomerisierung führte. Daher wurde im weiteren Verlauf des Projekts verstärkt auf Einzelmolekülfluoreszenztechniken gesetzt. Dazu wurden mikrostrukturierte Oberflächenfunktionalisierungen entwickelt, mit denen die Wechselwirkung von IFN mit der extrazellulären Domäne von IFNAR2 auf Einzelmolekülniveau quantifiziert werden konnten. Im Fokus des Projekts standen Oberflächenarchitekturen, mit denen der Transmembranrezeptor in Polymer-unterstützten Membranen (PSM) rekonstituiert werden konnten, welche eine laterale Diffusion der Untereinheiten und die IFN-induzierte Dimerisierung ermöglichten. Es zeigte sich, dass aufgrund der sehr schnellen Diffusion von Proteinen in PSM für quantitative Bindungsassays über Einzelmolekültracking laterale Diffusionsbarrieren benötigt wurden. Diese wurden durch mikrostrukturierte Membranen erreicht. In Kombination mit einer neuen Methode zum schnellen Transfer der Transmembranrezeptoren aus Säugerzellen in PSM konnte über Einzelmolekül-Kolokalisation zum ersten Mal Liganden-induzierte Rezeptordimerisierung in vitro nachgewiesen werden. Interessanterweise wurden deutliche Unterschiede für wildtyp IFNα2 und einer Mutante mit erhöhter Bindungsaffinität zu IFNAR1 beobachtet. Zudem gelang es, phasenseparierende Lipidmischungen als Modellsystem für lipid rafts in PSM zu realisieren. Über eine binäre mikrostrukturierte Oberflächenfunktionalisierung gelang es, die räumlich Anordnung von lo und ld Phasen zu kontrollieren. Allerdings wurde für keines der Transmembranproteine eine Partitionierung in die lo-Phase beobachtet. Als ein geeignetes in vitro Modellsystem zur Untersuchung der Rolle von Lipiddomänen für die Rezeptorassemblierung wurde eine Anbindung der extrazellulären Domänen von IFNAR1 und IFNAR2 über ein neuartiges multivalentes Chelatorlipid etabliert. Mit diesem System konnte eine Liganden-induzierte Partionierung von Rezeptorkomplexen in die lo-Phase nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen an artifiziellen Modellmembranen wurden durch Quantifizierung der Rezeptordimerisierung in der Plasmamembran lebender Zellen komplementiert. Hier zeigte es sich, dass auch wildtyp IFNα2 eine effiziente Rezeptordimerisierung ermöglicht, was teilweise auf zusätzliche Wechselwirkungen über die intrazelluläre Domäne und daran assoziierte Proteine zurückgeführt werden kann. Darüber hinaus weist der Vergleich der Ergebnisse aus rekonstituierten Modellsystemen und lebenden Zellen aber darauf hin, dass weiter Mechanismen der lateralen Organisation in der Plasmamembran zu der Rezeptordimerisierung beitragen.
Publications
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(2010) Functional immobilization and patterning of proteins by an enzymatic transfer reaction, Anal Chem 82, 1478-1485
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(2011) Maleimide photolithography for single-molecule protein-protein interaction analysis in micropatterns, Anal Chem 83, 501-508
Waichman, S., You, C., Beutel, O., Bhagawati, M., and Piehler, J.
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(2011) Reconstitution of membrane proteins into polymer-supported membranes for probing diffusion and interactions by single molecule techniques, Anal Chem 83, 6792-6799
Roder, F., Waichman, S., Paterok, D., Schubert, R., Richter, C., Liedberg, B., and Piehler, J.
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(2013) Diffusion and interaction dynamics of individual membrane protein complexes confined in micropatterned polymer-supported membranes, Small 9, 570-577
Waichman, S., Roder, F., Richter, C. P., Birkholz, O., and Piehler, J.
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(2013) Spatial organization of lipid phases in micropatterned polymer-supported membranes, J Am Chem Soc 135, 1189-1192
Roder, F., Birkholz, O., Beutel, O., Paterok, D., and Piehler, J.
