Die Bedeutung von TDG-abhängiger DNA-Demethylierung bei der Etablierung von Heterogenität in embryonalen Stammzellpopulationen und während der Differenzierung

• Antragstellerin: Dr. Christina Bauer
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 396808758

Heterogenität in Populationen embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) wird als Voraussetzung für die gerichtete Differenzierung diskutiert, da natürliche Schwankungen des zellulären Zustands durch Differenzierungssignale verstärkt oder unterdrückt werden können. Mit dem beschriebenen Projekt möchte ich die Heterogenität von Zellpopulationen während der Entwicklung von ES-Zellen der Maus zu Epiblasten-ähnlichen Zellen untersuchen. Dieses Zellkulturmodel spiegelt die Entwicklung während der embryonalen Einnistung wider, wo pluripotente Zellen auf die Differenzierung vorbereitet werden und die genomischen DNA-Methylierungsmuster gesetzt werden. Vorläufige Daten legen nahe, dass Schlüsselenzyme der DNA-Demethylierungsmaschinerie in Säugetieren, die Dioxygenaseen TET1 und TET2 sowie die DNA-Glykosylase TDG, eine zentrale Rolle in der Etablierung und Aufrechterhaltung der Heterogenität von Zellpopulationen spielt. Unterschiede zwischen einzelnen Zellen werden in einer induzierbaren Tdg-Knock-Out Zelllinie untersucht werden, in der das Tdg-Gen durch die Zugabe von Tamoxifen ins Zellkulturmedium entfernt werden kann. Zusätzlich werden ES-Zellen mit Defekten in den Genen von Tet1/Tet2/Tdg analysiert werden, um die Einflüsse von Oxidation der DNA-Methylierung einerseits und von Reparaturprozessen andererseits zu unterscheiden. Die Heterogenität der Zellpopulation soll hinsichtlich diverser Aspekte untersucht werden, um ein vollständiges Bild der spezifischen Rolle von TDG und der DNA-(De-)methylierungsmaschinerie zu erhalten. Erstens wird die Heterogenität der Transkription durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung analysiert werden. Zweitens werden Unterschiede in Proteinexpressionsleveln durch Immunfluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS) erfasst. Drittens werden homogene Subpopulationen der Gesamtpopulation identifiziert und isoliert werden. In diesen Subpopulationen werden DNA-Methylierungsmuster mit RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) analysiert und quantifiziert werden. Zuletzt sollen die in der Zellkultur erzielten Ergebnisse in vivo bestätigt werden, um ihre Rolle in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen. Die Resultate der geschilderten Experimente werden die Frage beantworten, wie TET/TDG-abhängige DNA-Demethylierung zur Heterogenität von Zellpopulationen beiträgt und ob diese Heterogenität für die Entwicklung von ES-Zellen zu Epiblast-ähnlichen Zellen und für die weitere Differenzierung essentiell ist. Die erzielten Daten werden das gegenwärtige Verständnis der Regulation und Dynamik von epigenetischer Heterogenität in ES-Zellen und ihrer Bedeutung während der Differenzierung signifikant erweiteren.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Schweiz
• Gastgeber: Professor Dr. Primo Schär