Die Entfernung der mRNA Kappe durch ApaH ähnliche Phosphatasen
Biochemie
Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die 5'-Enden eukaryotischer mRNAs werden normalerweise durch einen m 7G-Kappe geschützt, ein methyliertes Guanosin, das über eine Triphosphatbrücke mit dem ersten transkribierten Nukleotid verbunden ist. Spezielle Enzyme entfernen die Kappe während des mRNA-Abbaus. Die Nudix-Hydrolase DCP2 ist das kanonische „Decapping“ Enzym im 5'-3'- Abbauweg; das Enzym arbeitet in einem Komplex mit mehreren anderen Kofaktoren. Kinetoplastida haben sich sehr früh von der Hauptgruppe der Eukaryoten getrennt und besitzen keine Homologen zu den Proteinen des kanonischen DCP2-Decapping-Komplexes. Stattdessen verwenden sie die ApaH-ähnliche Phosphatase ALPH1, eine Pyrophosphatase der Proteinphosphatase (PPP)-Gruppe bakteriellen Ursprungs, die nicht mit den Nudix-Hydrolasen verwandt ist. ALPH1 besteht aus einer katalytischen Domäne und Kinetoplastidaspezifischen N- und C-terminalen Domänen. In diesem Projekt haben wir eine detaillierte Charakterisierung von ALPH1 durchgeführt. Wir haben eine Reihe von in-vitro-Decapping-Assays etabliert und die Substratspezifität und bevorzugten Reaktionsbedingungen für ALPH1 charakterisiert. Unsere Daten zeigen dass die Enzymaktivität ausschließlich von der katalytischen Domäne abhängt und dass ALPH1 ein breites Substratspektrum aufweist, einschließlich Cap-Analoga, mit einer klaren Präferenz für nicht methylierte Kappen. Diese ungewöhnliche Substratpräferenz könnte die evolutionäre Herkunft von ALPH1 vom bakteriellen ApaH widerspiegeln. Wir haben die ALPH1- Interaktionspartner mit Hilfe von verschiedenen BioID und Immunpräzipitationen definiert. Der so definierte innere Decapping-Komplex besteht aus fünf Proteinen, einschließlich ALPH1 und 5'-3'-Exoribonuklease XRNA, die alle eine ungewöhnliche Lokalisation am posterioren Ende der Zelle aufweisen. Wir haben einen in silico Screen für ApaH-ähnliche Phosphatasen in allen Eukaryoten durchgeführt und festgestellt, dass mRNA-Decapping durch diese Enzymgruppe einzigartig für Kinetoplastida ist, da andere Eukaryoten entweder keine ALPH-Proteine oder nur sehr kurze besitzen, die zudem weitestgehend nicht im Zytoplasma lokalisiert sind. Unsere Daten bilden die Grundlage für einen zielbasierten Wirkstoff-Screen, der die vernachlässigten Tropenkrankheiten, die durch Kinetoplastida verursacht werden (Afrikanische Schlafkrankheit, Leishmaniose, Chagas-Krankheit), behandeln soll, sowie für ein besseres Verständnis der Regulation des mRNA-Abbaus in Kinetoplastida. Darüber hinaus können ApaH-ähnliche Phosphatasen als "vernachlässigte Enzyme" betrachtet werden: Sie sind weit verbreitet unter Eukaryoten (außer in Säugetieren), aber mit Ausnahme von Ppn2 aus Hefen existiert bisher keine funktionelle Characterisierung. Wir arbeiten daran, diese Lücke zu schließen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The complex enzymology of mRNA decapping: Enzymes of four classes cleave pyrophosphate bonds. WIREs RNA, 10(1).
Kramer, Susanne & McLennan, Alexander G.
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Is mRNA decapping by ApaH like phosphatases present in eukaryotes beyond the Kinetoplastida?. BMC Ecology and Evolution, 21(1).
Castañeda, Londoño Paula Andrea; Banholzer, Nicole; Bannermann, Bridget & Kramer, Susanne
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A unique mRNA decapping complex in trypanosomes. Nucleic Acids Research, 51(14), 7520-7540.
Kramer, Susanne; Karolak, Natalia Katarzyna; Odenwald, Johanna; Gabiatti, Bernardo; Castañeda, Londoño Paula Andrea; Zavřelová, Anna; Freire, Eden Ribeiro; Almeida, Kayo Schemiko; Braune, Silke; Moreira, Claudia; Eder, Amelie; Goos, Carina; Field, Mark; Carrington, Mark; Holetz, Fabiola; Górna, Maria Wiktoria & Zoltner, Martin
