Erythropoetin vermittelte Neuroprotektion durch den Zytokinrezeptor-like Faktor3-Rezeptor

• Antragsteller: Professor Dr. Ralf Heinrich, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 398214842

Gene für Erythropoietin (Epo) wurden in Vertebraten (von Mensch bis Fisch) identifiziert. Neben der regulatorischen Funktion bei der Blutbildung wirkt dieses Zytokin im Nervensystem der Säugetiere protektiv und regenerationsfördernd. Endogene Epo-Spleißvarianten (EV-3) mit neuroprotektiver aber nicht erythropoetischer Wirkung belegen die Existenz eines neuroprotektiven Epo-Rezeptors, der sich von dem homodimeren „klassischen“ Epo-Rezeptor der Blutbildung unterscheidet. Die Familie der Typ I Zytokinrezeptoren enthält neben dem klassischen Epo-Rezeptor auch den bei Wirbeltieren (inklusive Mensch) und Insekten vorkommenden orphanen Cytokine Receptor-like Factor 3 (CRLF3). Wir konnten kürzlich nachweisen, dass CRLF3 ein neuroprotektiver Epo-Rezeptor im Käfer T. castaneum ist.Das zur Förderung beantragte Projekt soll die Funktion des CRLF3 Rezeptors in Insekten und humanen Zelllinien charakterisieren. Folgende Fragen sollen dabei beantwortet werden:1) Ist CRLF3 ein neuroprotektiver Epo-Rezeptor im Menschen? Humane Zelllinien, die unterschiedlichen Geweben entstammen und den CRLF3 Rezeptor endogen exprimieren, sollen in Hypoxie-Assays auf neuroprotektive Wirkungen von Epo und EV-3 untersucht werden. Vergleiche mit Zelllinien, die CRLF3 gesteigert oder reduziert exprimieren, sollen Aufschluss über die Beteiligung des CRLF3 an den neuroprotektiven Mechanismen geben.2) Induziert heterologe Expression von CRLF3 aus Käfern Epo-sensitive Drosophila Zellen? D. melanogaster enthält kein CRLF3 Ortholog und Epo zeigt keine protektive Wirkung auf Drosophila Zellen, obwohl alle anderen Komponenten des Epo-induzierten Transduktionsprozesses vorhanden sind. CRLF3 aus T. castaneum soll heterolog in S2- und MB-DmBG2-Zelllinien exprimiert werden, um Epo-sensitive Drosophila Zellen zu generieren. Falls erfolgreich, soll auch versucht werden, humanes CRLF3 in Drosophila Zellen zu exprimieren. CRLF3-exprimierende Drosophila Zelllinien sollen als zuverlässiger und schneller Assay für Screens potentiell neuroprotektiv wirkender Epo-Mimetika dienen.3) Welche Gewebe exprimieren CRLF3 und was ist seine Funktion in Insekten? CRLF3-Expression soll durch in situ-Hybridisierung in Embryos, Larven und pharaten Puppen von T. castaneum untersucht werden. Um die Funktion des CRLF3 zu ermitteln, soll dessen Expression in dieselben Entwicklungsstadien mittels systemischer RNAi unterdrückt und Auswirkungen auf die Morphologie und Funktionalität untersucht werden.4) Was ist das endogene „Epo-like“ Signalmolekül in Insekten? Extrakte Hypoxie-stimulierter Nervensysteme von T. castaneum sollen fraktioniert werden und einzelne Fraktionen in Hypoxie-Assays auf neuroprotektive Wirkungen getestet werden. CRLF3-eGFP hochexprimierende Zellen sollen zum Crosslinken des markierten Rezeptors mit Epo-mimetische Liganden genutzt werden. „Neuroprotektive Extrakte“ und Rezeptor/Liganden Komplexe werden anschließend weiter aufgetrennt und ihre Bestandteile massenspektrometrisch analysiert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen