Untersuchung der SUMOylierung des CLIP (chromatin linkage of INM protein) Komplexes in rDNA Lokalisierung und Stabilität

• Antragsteller: Professor Dr. Sigurd Braun
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 401430508

• Erstellungsjahr: 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Eukaryotische Genome bestehen zu großen Anteilen aus „fragilen“ Regionen, die anfällig für DNA-Strangbrüche sind. Viele dieser fragilen Bereiche haben repetitive DNA-Sequenzen, deren Reparatur meist durch homologe Rekombination (HR) erfolgt. Hierdurch kann es jedoch zu genetischen Veränderungen kommen. Unkontrollierte Rekombinationen können neurodegenerative Erkrankungen und Krebs zur Folge haben. Daher sind repetitive DNA-Sequenzen meist abgeschirmt von den Reparaturfaktoren und liegen in speziellen Kompartimenten vor. So enthält z.B. der Nukleolus hunderte Kopien von ribosomaler DNA (rDNA). Was aber geschieht, wenn es zur Schädigung von rDNA-Abschnitten kommt? Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass geschädigte rDNA-Abschnitte transient den Nukleolus verlassen können und so Zugang zur Reparaturmaschinerie erhalten. Allerdings war der genaue Mechanismus bislang nicht bekannt. In den Arbeiten zu diesem Projekt konnten wir wesentliche Schritte in dem Mechanismus aufdecken, wie rDNA-Abschnitte nach DNA-Schäden aus dem Nukleolus freigesetzt werden. In dem Modellorganismus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) sind rDNA-Abschnitte im Nukleolus an die Zellkernmembran gebunden mittels zweier Proteinkomplexe, Cohibin und CLIP. Der Cohibin-Komplex bindet direkt an die rDNA-Abschnitte, während der CLIP-Komplex aus zwei integralen Membranproteinen besteht und Teil der inneren Zellkernmembran ist. Zusammen bilden Cohbin und CLIP den „rDNA Tethering-Komplex“. Durch eine Kombination aus biochemischen Experimenten, Mikroskopie und Hefegenetik konnten wir zeigen, dass mehrere Schritte die rDNA-Freisetzung aus der Kernmembran ins Nukleoplasma auslösen. Zuerst führt DNA-Schädigung zur Phosphorylierung von CLIP, welches wiederum die Verknüpfung mit SUMO (small ubiquitin-like modifier) mit Proteinen beider Komplexe fördert. Mit SUMO-markierte Protein werden von unterschiedlichen molekularen Maschinen erkannt, wie z.B. dem ATP-abhängigen Chaperon Cdc48 (p97 bei Säugern). Wir konnten zeigen, dass Cdc48 über sein Adapterprotein Ufd1 an den SUMOylierten Tethering-Komplex bindet und die Interaktion zwischen den Partnern aufbricht. Dies bewirkt die Freisetzung der beschädigten rDNA-Abschnitte ins Nukleoplasma und Zugang zur HR-Maschinerie. Eine wichtige Beobachtung war, dass rDNA- Freisetzung nach DNA-Schäden auch in Säugetierzellen Cdc48/p97 braucht. Dies deutet darauf hin, dass dieser Reparaturmechanismus auch in höheren Eukaryoten konserviert ist. Diese Ergebnisse liefern entscheidende Einblicke, wie die Reparatur von DNA-Schäden dynamisch reguliert ist. Hefezellen, denen der Tethering-Mechanismus fehlt, zeigen Hyperrekombination und Verlust von einzelnen rDNA-Kopien, ähnlich wie bei Tumorerkrankungen. Umgekehrt sind Zellen, denen die Fähigkeit fehlt, rDNA aus der Zellkernmembran zu lösen, nicht lebensfähig, wie wir zeigen konnten. Dies impliziert, dass rDNA-Freisetzung in eukaryotischen Zellen häufig stattfindet und macht die Relevanz dieses Regulationsmechanismus‘ deutlich.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Neutral epigenetic inheritance: being prepared for future generations. Nature Structural & Molecular Biology, 26(6), 391-392.
  Capella, Matías & Braun, Sigurd
  
• ESCRT recruitment by the S. cerevisiae inner nuclear membrane protein Heh1 is regulated by Hub1-mediated alternative splicing. Journal of Cell Science, 133(24).
  Capella, Matías; Martín, Caballero Lucía; Pfander, Boris; Braun, Sigurd & Jentsch, Stefan
  
• ESCRTing Heterochromatin Out of the Nuclear Periphery. Developmental Cell, 53(1), 3-5.
  Capella, Matías & Braun, Sigurd
  
• Nucleolar release of rDNA repeats for repair involves SUMO-mediated untethering by the Cdc48/p97 segregase. Nature Communications, 12(1).
  Capella, Matías; Mandemaker, Imke K.; Martín, Caballero Lucía; den, Brave Fabian; Pfander, Boris; Ladurner, Andreas G.; Jentsch, Stefan & Braun, Sigurd
  
• The inner nuclear membrane protein Lem2 coordinates RNA degradation at the nuclear periphery. Nature Structural & Molecular Biology, 29(9), 910-921.
  Martín, Caballero Lucía; Capella, Matías; Barrales, Ramón Ramos; Dobrev, Nikolay; van Emden, Thomas; Hirano, Yasuhiro; Suma, Sreechakram Vishnu N.; Fischer-Burkart, Sabine; Kinugasa, Yasuha; Nevers, Alicia; Rougemaille, Mathieu; Sinning, Irmgard; Fischer, Tamás; Hiraoka, Yasushi & Braun, Sigurd