Herpesvirale mRNP-Bildung: Identifizierung der zellulären Ko-Faktoren und der Zielspezifität

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Jens Bohne
• Fachliche Zuordnung: Virologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 403670311

Viren sind zelluläre Parasiten und damit abhängig von der zellulären Genexpression und ihren Maschinerien. Herpesviren, als komplexe DNA-Viren, etablieren in ihren Wirten eine lebenslange Persistenz. Dabei wechseln sich latente und lytische Phasen ab. In der Latenz bleibt das Virus still, hingegen ist die lytische Phase durch eine massive Hochregulation der viralen Genexpression und die Freisetzung von viralen Partikeln gekennzeichnet. Das Genom des Kaposis-Sarkoma-assoziierten Herpesvirus (KSHV) ist 165kb groß und nur 25% aller viralen Gene enthalten Introns. Jedoch ist das Spleißen der Introns für die mRNA-Biogenese sehr wichtig und um dies auszugleichen, kodieren alle Herpesviren für post-transkriptionelle Regulatorproteine. Bei KSHV führt ORF57 zur Bildung eines export-kompetenten mRNA-Protein Komplexes (mRNP). Wie ORF57 die viralen RNAs erkennt, ist nicht bekannt, wohl aber verschiedene Interaktionen mit zellulären Proteinen, die die nachfolgenden Prozesse beeinflussen. Die geringe Affinität von ORF57 zu RNA und seine viele unstrukturierte Protein-Domänen erschweren die Analyse. Wir fragten uns, welche Determinanten gibt es auf den ORF57-abhängigne viralen RNAs? Als Antwort entwickelten wir das Konzept des viralen mRNP Codes basierend auf der Sequenz-Zusammensetzung der lytischen RNAs. Nach unserer Arbeitshypothese codieren die viralen RNAs für Bindungsmotive von spezifischen zellulären RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die teilweise in Sekundärstrukturen eingebettet sind. Um diese potentiellen, zellulären Interaktionspartner von ORF57 zu finden, werden wir uns einer neuen Methode zur Präzipitation von spezifischen mRNP-Komplexen bedienen: 'LNA mRNP capture'. Die Methode kann distinkten mRNPs durch Bindung von sequenz-spezifischen Oligonukleotiden aufreinigen. Eine Alternative zu einem zellulären Ko-Faktor für ORF57 wäre, basierend auf der RNA-Erkennung des bakteriellen C5 Proteins, eine 'versteckte Spezifität' statt einem starken Motiv. Das Mandel-Gutfreund Labor wird dafür neue Algorithmen entwickeln und einen 'machine learning approach' anwenden, um Sequenzattribute in den ORF57-abhängigen RNA-Sequenzen zu finden. Zusätzlich soll ein neues Analysewerkzeug die Details von unstrukturierten Protein-Domänen, wie z. B. die RNA-bindende Domäne bei ORF57, besser erfassen. Zuletzt möchten wir die RNA-Struktur der lytischen KSHV RNAs mit DMSseq aufklären. Diese in-vivo Methode kombiniert Strukturanalyse mit Tiefensequenzierung. Zusätzlich werden wir putative Zielstrukturen mit 'in-line probing' verifizieren, alles mit dem Ziel putative Bindungsstellen einzugrenzen. Diese Kandidaten-Motive werden dann in einem 'proximity ligation assay' auf ihre in-vivo Bindung durch ORF57 getestet. Diese Ergebnisse sollen auch auf andere ORF57-Homologe (Epstein-Barr Virus; Varizella Zoster Virus) übertragen werden. Erste Ergebnisse zeigen eine ähnliche Funktionsweise dieser Proteine. Unsere Daten werden auch helfen, den zellulären mRNP Code besser zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Israel
• ausländ. Mitantragstellerin: Professorin Dr. Yael Mandel-Gutfreund