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Engineering von O2-toleranten Hydrogenasen und ihre physiologischen Auswirkungen in rekombinanten Bakterien im Hinblick auf die Hydrogenase-abhängige NAD(P)H-Regeneration und H2-Produktion

Fachliche Zuordnung Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Biochemie
Förderung Förderung von 2018 bis 2022
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405325648
 
Erstellungsjahr 2022

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Die Produktion von biologischem und grünem H2 hat erhebliche technologische Auswirkungen, da H2 als emissionsfreier Energieträger der Zukunft gilt. Die H2 umsetzenden Hydrogenasen sind daher mehr und mehr in den Fokus der Wissenschaft gerückt, insbesondere die O2- tolerante NAD+-reduzierende Hydrogenase aus Cupriavidus necator (CnSH). Diese ist in der Lage H2 zu produzieren, womit sie ein interessanter Kandidat für die lichtgetriebene Biowasserstoff-Synthese ist. Andererseits katalysiert sie auch die H2-Oxidation und überträgt dabei Elektronen auf Redox-Cofaktoren, welche für eine Vielzahl industriell relevanter Reaktionen vonnöten sind. Sie stellt daher ein interessantes Werkzeug für die Biotechnologie dar. Im Zuge dieses Projekts wurde die CnSH erfolgreich in dem photoautotrophen Organismus Synechocystis sp. PCC6803 integriert. Die Funktionalität der in Cyanobakterien produzierten CnSH konnte sowohl in Hinsicht auf H2-Verbrauch als auch fermentative H2-Produktion nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte auch der Erhalt der O2-Toleranz festgestellt werden. Für die Kopplung der CnSH mit dem Photosystem I wurden die Eigenschaften der Ferredoxin-interagierenden cyanobakteriellen Hydrogenase aus Synechocystis untersucht und chimäre Hydrogenasen entwickelt, welche relevante Eigenschaften beider Enzyme, O2-Toleranz und Ferredoxin-Interaktion, kombinieren. Insbesondere die Chimären MixSH und Ch- 30 stellen vielversprechende Kandidaten dar. Ebenfalls konnte der Einsatz der CnSH als H2-getriebenes Kofaktor-Recycling-System für diverse Biotransformationen etabliert werden. Dafür wurde unter anderem mittels Protein- Engineering das Substartspektrum der CnSH auf NADPH erweitert. Die daraus resultierende CnSH-Variante E341A/S342R konnte erfolgreich als Regenerationssystem für NADPH- abhängige Enzyme eingesetzt werden. Insbesondere für die Imin-Reduktase konnte ein vollständiger Umsatz sowie eine nahezu 100%ige Selektivität gezeigt werden. Darüber hinaus konnte sie in Kombination mit einer O2-abhängigen P450-Monooxygenase eingesetzt werden. Neben dem Einsatz als Regenerationssystem für NAD(P)H konnte die CnSH als Regenerationssystem für Flavin-abhängige Enzyme etabliert werden. Für die Enreduktase TsOYE konnte der FMNH2-abhängige Umsatz diverser cyclischer Enone gezeigt werden mit Substratumwandlungen von teilweise bis nahezu 100%. Darüber hinaus wurde sie auch erfolgreich als Regenerationssystem für FADH2 in Kombination mit der Styrolmonooxygenase StyA eingesetzt. Um die CnSH zukünftig auch in Ganzzell-Systemen als Regenerationssystem anwenden zu können, wurde ein verbessertes System für die heterologe Produktion der CnSH in E. coli entwickelt. Insbesondere wurde ein Set diverser Kultivierungsmöglichkeiten erstellt, wodurch die Kopplung mit den unterschiedlichsten Oxidoreduktasen ermöglicht werden kann. Zusätzlich wurde ein System für die heterologe Produktion der NADH-abhängigen löslichen Methan-Monooxygenase in E. coli entwickelt. Die Kombination der sMMO mit der CnSH als NADH-Regenerationssystem stellt eine vielversprechende Möglichkeit der H2-getriebenen Alkan-Hydroxylierung dar. Die Ergebnisse stellen somit einen wichtigen Schritt für eine zukünftige lichtgetriebene H2-Produktion wie auch für die H2-getriebene Kofaktor-Regeneration dar.

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