Infektionsfreie und skalierbare Herstellung von DNA-Oligonukleotiden zur Massenproduktion von Nanoobjekten über Selbstassemblierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Künstliche einzelsträngige DNA (ssDNA) mit benutzerdefinierten Sequenzen und Längen bis in den Kilobasenbereich wird zunehmend in großen Mengen benötigt, um das Potenzial neuer Technologien wie Genome Editing und DNA-Origami auszuschöpfen. Derzeit verfügbare biotechnologische Ansätze zur Massenproduktion von ssDNA erfordern jedoch eine dedizierte und damit kostspielige Fermentationsinfrastruktur, da das Risiko besteht, dass Herstelleranlagen mit selbstreplizierenden Phagen kreuzkontaminiert werden. In diesem Projekt gelang es uns dieses Problem zu überwinden. Dazu haben wir eine effiziente, skalierbare und kreuzkontaminationsfreien Methode zur phagenfreien biotechnologischen Herstellung künstlicher ssDNA mit Escherichia coli erarbeitet. Unser neues Produktionssystem verwendet ein speziell entworfenes Phagemid und ein optimiertes Helferplasmid. Das Phagemid kodiert für ein Gen des M13-Phagengenoms und eine frei gewählte kundenspezifische Zielsequenz, während das Helferplasmid die anderen Gene des M13-Phagen kodiert. Die mit diesem Verfahren hergestellten Phagemidpartikel sind in Abwesenheit des Helferplasmids nicht zur Selbstreplikation fähig. Dies ermöglicht erstmalig eine kreuzkontaminationsfreie biotechnologische Produktion von ssDNA bei jedem Auftragshersteller. Darüber hinaus wurde das Fermentationsverfahren optimiert, um Nebenprodukte zu reduzieren, und die maximale Produktkonzentration auf bis zu 83 mg L-1 ssDNA in einem Rührkesselreaktor erhöht, wodurch eine bis zu 40-fache Steigerung der maximalen Produktkonzentration gegenüber früheren skalierbaren ss-DNA-Produktionsmethoden erreicht wurde. Damit ist ein weiterer Meilenstein hin zur industriellen Nutzung der DNA Nanotechnologie erfolgreich erreicht und sichtbar publiziert worden. Die Hochskalierung in den 1000 L Pilotmaßstab erfolgt zurzeit und wird dann ebenfalls in Folge publiziert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Phagen-freie Herstellung von Einzelstrang-DNA mit nutzerdefinierter Sequenz mit Escherichia coli. Dissertation TUM, eingereicht im Juni 2022, von der TUM School of Engineering and Design angenommen im Oktober 2022, Doktorprüfung im Dezember 2022
Behler K.
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Phage‐free production of artificial ssDNA with Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 119(10), 2878-2889.
Behler, Karl L.; Honemann, Maximilian N.; Silva‐Santos, Ana R.; Dietz, Hendrik & Weuster‐Botz, Dirk
