MK2/3-abhängige Mechanismen der durch RIPK1-Phosphorylierung gesteuerten Regulation von Entzündung und Zelltod
Biochemie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Signalübertragungsmechanismen des TNF-Rezeptor-Komplexes werden international intensiv und kompetitiv untersucht. Ausgehend von dem Befund, dass die Proteinkinase MK2 das Protein RIPK1 an den Serinresten S321 und S336 phosphoryliert und damit dessen pro-apoptotische Rolle in bestimmten Zellen neutralisiert, sollte in diesem Forschungsvorhaben untersucht werden, welche molekularen Mechanismen diesem Effekt zugrunde liegen und welche Signalmechanismen involviert sind. Dabei sollten insbesondere die MK2-abhängige subzelluläre Lokalisation und die MK2-abhängigen Substrate und Wechselwirkungspartner von RIPK1 untersucht werden. Darüber hinaus sollte der Einfluss der Phosphorylierung von RIPK1 auf die TNF-Rezeptor-vermittelte Zytokinproduktion ermittelt werden. Während wir uns auf MK2-abhängige Mechanismen konzentrieren wollten, wurden in der Laufzeit dieses Projektes allerdings eine Vielzahl von zusätzlichen post-translationalen Modifikationen von RIPK1 bekannt - etwa 30 verschiedene Ubiquitinylierungen und 40 verschiedene Phosphorylierungen und auto-Phosphorylierungen - und neben MK2 und IKK1/2 weitere Proteinkinasen, die RIPK1 phosphorylieren, identifiziert, wie z.B. TAK1, TBK1, IKKε und ULK1. Da diese ebenfalls stress-aktivierten Proteinkinasen teilweise dieselben Serinreste phosphorylieren, gestaltete sich die funktionelle Analyse der MK2-spezifischen Phosphorylierung zunehmend schwierig. So wurden phosphorylierungsspezifische Antikörper für pS320/321 sowie eine RIPK1-S321A knock-in Zelllinie von uns generiert, konnten aber aufgrund der Interferenzen mit den anderen Proteinkinasen nicht zur Analyse von MK2-abhängigen Effekten von RIPK1 verwendet werden. Deshalb haben wir uns dann auf die Suche MK2-abhängiger Wechselwirkungspartner von RIPK1 durch SILAC- Experimente konzentriert. Von diesen wurde die Arginine-Methyltransferase PRMT5 weiter untersucht und als das verantwortliche Enzym für die Modifikation von RIPK3 innerhalb des nekroptotischen RIPK1/RIPK3-Komplexes identifiziert. Damit konnte eine neue, regulatorische Modifikation von RIPK3 ermittelt werden. Bei der weiteren Analyse der MK2-RIPK1-spezifischen Rolle für die TNF-Rezeptor-vermittelte Zytokinexpression konnte eine spezifische Rolle für Csf3 (G-CSF), welches in Abwesenheit von MK2 stärker RIPK1-abhängig exprimiert wird, eindeutig nachgewiesen werden. Das Screening einer Kinaseinhibitor-Bibliothek in MK2-defizienten und MK2-rekonstruierten Zellen ermöglichte die Identifizierung von 5-Iodotubericidin (5-ITu) als Substanz, die RIPK1-abhängigen Zelltod fast ausschließlich in MK2-defizienten Zellen induziert. Diese Resultate könnten eine Grundlage für weitere Wege zum Verständnis der Rolle der Proteinkinase MK2 innerhalb des komplexen Szenarios der PTM-vermittelten Funktion des TNF-Rezeptorkomplexes bilden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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5-Iodotubercidin sensitizes cells to RIPK1-dependent necroptosis by interfering with NFκB signaling. Cell Death Discovery, 9(1).
Chauhan, Chanchal; Kraemer, Andreas; Knapp, Stefan; Windheim, Mark; Kotlyarov, Alexey; Menon, Manoj B. & Gaestel, Matthias
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PRMT5-mediated regulatory arginine methylation of RIPK3. Cell Death Discovery, 9(1).
Chauhan, Chanchal; Martinez-Val, Ana; Niedenthal, Rainer; Olsen, Jesper Velgaard; Kotlyarov, Alexey; Bekker-Jensen, Simon; Gaestel, Matthias & Menon, Manoj B.
