Einzelmolekülanalyse nicht kanonischer Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexe und Charakterisierung archaeeller solo-Cas4 Proteinvarianten

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dina Grohmann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405973986

Es wird zunehmend deutlich, dass einzelne Komponenten von oder komplette CRISPR-Cas Maschinerien Funktionen außerhalb ihrer kanonischen Rolle als adaptives Immunsystem in prokaryotischen Zellen wahrnehmen. Unter anderem scheint CRISPR-Cas in die posttranskriptionelle Genregulation, in die Regulation bakterieller Virulenz, der DNA Reparatur, Induktion von Ruhestadien der bakteriellen Zelle, Infektion und Genomevolution involviert zu sein. Wir möchten zum molekularen Verständnis der nicht-kanonischen Funktionen von CRISPR-Cas beitragen, indem wir Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen von Cas1 und Cas9 in nicht-kanonischen zellulären Komplexen mit Hilfe der umfassenden Möglichkeiten der Einzelmolekül-Analyse in Kombination mit klassischer Biochemie gewinnen. Folgende Projekte möchten wir im SPP2141 verfolgen: i) Cas9 Varianten sind als Einzel-Effektor-Proteine normalerweise in die crispr-RNA vermittelte DNA-Spaltung involviert. Die Cas9 Variante aus Franciscella novicida formt jedoch einen ungewöhnlichen Komplex bestehend aus scaRNA, tracrRNA und der mRNA, die das blp Protein kodiert. Dieser Komplex führt schlussendlich zur Degradation der blp mRNA. Kürzlich hat sich zudem gezeigt, dass auch die Cas9 Variante aus Campylobacter jejuni (dem kleinsten bekannten Cas9 Protein) ebenfalls an mRNAs bindet und einen crisprRNA/tracrRNA/mRNA/Cas9 formen kann. Wie unterscheiden sich diese Komplex strukturell und ihrem dynamischen Verhalten von kanonischen crRNA/tracrRNA/dsDNA/Cas9-Komplexen? Einzelmolekül-FRET-Messungen können in diesem Zusammenhang ausgenutzt werden, um diese bisher unbeantwortete Frage zu beantworten. ii) Für das Cas1 Protein aus E. coli und P. furiosus konnte gezeigt werden, dass es neben seiner kanonischen Interaktion mit Cas2 auch mit Komponenten der DNA Reparatur- und Rekombinationsmaschinerie (bspw. RecB, RecC, RuvB and UvrC) interagiert. Einzelmolekül-Pulldown-Experimente erlauben die Isolation dieser Komplexe direkt aus dem Zellextrakt ohne dass diese Komplexe in vitro rekonstituiert werden müssen. In Kombination mit Einzelmolekül-FRET-Experimente sollen Erkenntnisse über die Stöchiometrie, Interaktionen und das funktionelle Zusammenspiel dieser Komplexe gewonnen werden. Diese Experimente sollen zusätzlich durch Studien in vivo ergänz werden. Hier sollen die neuesten Superauflösungsmikroskopie-Verfahren zum Einsatz kommen, um die Lokalisation und Dynamik von Cas1 in der Zelle zu bestimmen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2141: Weitaus mehr als nur Verteidigung: die vielen verschiedenen Funktionen des CRISPR-Cas Systems