Mechanismen und Funktionen der Bindung und Prozessierung von endogenen RNAs durch CRISPR-Cas9 in Campylobacter jejuni

• Antragstellerin: Professorin Dr. Cynthia Mira Sharma
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405974737

Die Typ-II-CRISPR-Cas9-Nuklease nutzt crRNAs und tracrRNA, um doppelsträngige Fremd-DNA zu schneiden. Es gibt zunehmend Hinweise, dass CRISPR-Cas-Systeme neben ihrer bekannten Rolle in der adaptiven Immunität weitere Funktionen haben und z.B. bakterielle Virulenz regulieren. Beispielsweise vermindert die Deletion von Typ-II-Komponenten die Virulenz verschiedener Pathogene wie Francisella novicida, Neisseria meningitidis und Campylobacter jejuni. Zudem wurde vor kurzem gezeigt, dass Cas9 auch RNA binden und schneiden kann, wobei dies Nukleasemodifikationen oder Hilfsfaktoren erforderte. F. novicida Cas9, zum Beispiel, benutzt eine scaRNA zusätzlich zur tracrRNA, um eine Lipoprotein-mRNA und dadurch die Virulenz zu regulieren. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unklar.In unserer Transkriptomanalyse mehrerer Stämme des Lebensmittelkeims C. jejuni haben wir ein stark exprimiertes Typ-II-C-CRISPR-Cas-System mit minimaler crRNA-Biogenese identifiziert. Zudem zeigen unsere unpublizierten RIP-seq-Experimente (co-immunoprecipitation combined with RNA-seq), dass C. jejuni-Cas9 (CjCas9) native crRNAs nutzt, um komplementäre endogene mRNAs zu binden und zu schneiden. Circa 100 Transkripte konnten zusammen mit CjCas9 aufgereinigt werden und lassen sich entsprechend ihrer Komplementarität zu den vier C. jejuni crRNAs unterteilen. Viele dieser RNAs werden nahe der crRNA-Bindestellen prozessiert. Mutationsanalysen zeigten, dass dieser Prozess von der CjCas9-HNH-Domäne und den tracr- und crRNAs abhängig ist. Zudem konnten wir die RNA-Prozessierung durch CjCas9 in vitro programmieren und zeigen, dass die Ziel-RNA mit zunehmender Komplementarität zur crRNA-Guidesequenz stärker geschnitten wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass CjCas9 sowohl RNA als auch DNA binden und schneiden kann.In diesem Projekt werden wir die physiologische Rolle, sowie die molekularen Mechanismen der RNA-Binding und -Prozessierung durch CjCas9 untersuchen. Hierbei möchten wir herausfinden, ob Cas9 zur Genregulierung beiträgt, oder ob es sich bei der RNA-Bindung/Prozessierung um einen Nebeneffekt der Immunität handelt. RIP-seq von CjCas9 in Stämmen mit unterschiedlichen crRNAs wird zeigen, ob die Bindung endogener RNAs ein generelles Phänomen ist und crRNA-anhängige und -unabhängigen Regulons aufzeigen. Expressionsanalysen in Regulatormutanten und unter verschiedenen Bedingungen werden zeigen, wie CRISPR-Cas reguliert ist, und somit Rückschlüsse auf die Funktion erlauben. Mittels RNA-seq und Ribosome-Profiling von Mutanten werden wir die post-transkriptionelle Regulierung und Prozessierung durch Cas9 global untersuchen. Mittels genetischer und biochemischer Ansätze werden wir CjCas9-Ziel-RNAs validieren und die Mechanismen der Regulierung analysieren. Abschließend werden wir untersuchen, ob RNA-Prozessierung durch CjCas9 die Virulenz beeinflusst. Insgesamt wird dies zu einem besseren Verständnis der Rolle von CRISPR-Cas in bakterieller Genregulierung und Pathogenität beitragen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2141: Weitaus mehr als nur Verteidigung: die vielen verschiedenen Funktionen des CRISPR-Cas Systems