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Projekt
Untersuchung der Proteinorganization und -dynamik des Typ I-Fv CRISPR-Cas-Systems von Shewanella putrefaciens CN-32 mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in lebenden Zellen
Antragstellerin
Professorin Dr. Ulrike Endesfelder
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Biophysik
Biophysik
Förderung
Förderung seit 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405974843
Die verschiedenen CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated proteins) Systeme teilen einige konservierte Elemente, sind jedoch im Allgemeinen sehr variabel. Während die Organisation des Typ-II-Systems und seines Schlüsselproteins Cas9 bereits in lebenden Zellen mit Einzelmolekültechniken untersucht wurden, stammen die Informationen zu Einzelmolekül(-inter-)dynamiken der Proteine des Typ-I-System ausschließlich aus in-vitro-Versuchen.Es häufen sich jedoch die Hinweise, dass die Interaktionen von CRISPR-Cas-Sytemen mit ihrer intrazellulären Umgebung sehr viel komplexer sind als ursprünglich angenommen und weit über die eines monofunktionalen Antivirus-Verteidigungsmechanismus hinausgehen. Es wird daher zunehmend deutlich, dass es nicht genügt CRISPR-Cas-Systeme isoliert zu betrachtet um ihren vollen Funktionsumfang zu erschließen.In Rahmen dieses Projekts werden wir das minimale CRISPR-Cas-Typ-I-Fv-System aus Shewanella putrefaciens CN-32 in vivo mithilfe von single-molecule localization microscopy (SMLM) und single-particle tracking (SPT) untersuchen. SMLM ermöglicht es uns einzelne Cas-Moleküle mit einer höhen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu lokalisieren und, mittels SPT, ihre Diffusionsdynamik unter verschiedenen Bedingungen und bei verschieden starker Übereinstimmung mit der Zielsequenz zu charakterisieren.Im Einzelnen planen wir• die Kinetik des Cascade-Typ-I-Fv-Komplexes in lebenden Zellen zeitlich und räumlich charakterisieren,• die Kinetik und die Molekülinteraktionen bei der PAM-Erkennung und der R-loop-Stabilisierung bestimmen,• und die Bedeutung von Interaktionen zwischen den Cascade-Komplexen und anderen molekularen Maschinerien erforschen.Darüber hinaus planen wir robuste SPT- und SMLM-Verfahren für verschiedene weniger geeigneten Mikroorganismen zu etablieren, um CRISPR-Cas-Systeme auch in ihrem natürlichen Umfeld untersuchen zu können.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
