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Investigations into the Distribution, the Biological Role and the Evolution of Lipoxygenases. Functional Charcterization of Genetically Modified Mice with Humanized Reaction Specificity.

Subject Area Biochemistry
Developmental Biology
Term from 2018 to 2023
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 405976130
 
Final Report Year 2024

Final Report Abstract

Lipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind an der Regulation der zellulären Redoxhomöostase beteiligt und spielen für die Biosynthese von pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren eine wichtige Rolle. Ziel des vorliegenden Forschungsprojektes war es, ein genaueres Bild zum Vorkommen, zu den biologischen Funktionen und zur Evolution von Lipoxygenasen zu erhalten. Zu Beginn unserer Arbeiten war der Lipoxygenasestoffwechsel von Menschen und Mäusen bereits gut charakterisiert. Es war aber weitgehend unklar, wie dieser Stoffwechselweg bei anderen Säugetieren strukturiert ist und mit welcher Häufigkeit ALOX-Isoformen in verschiedenen irdischen Lebensformen (Viren, Bakterien, Archaeen, niedere und höhere Wirbeltiere) vorkommen. Um diese Lücke zu schließen, haben wir zunächst das Vorkommen von Lipoxygenasegenen in den Genomen von Viren, Bakterien, Archaeen und Wirbeltieren untersucht. Ausgewählte ALOX-Isoformen wurden als rekombinante Proteine exprimiert und hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften charakterisiert. Dabei haben wir festgestellt (Subprojekt 1), dass in den bisher sequenzierten Virusgenomen Lipoxygenasegene fehlen. In Bakterien kommen ALOX-Gene zwar vereinzelt vor, zeigen aber eine geringe Verbreitung. In weniger als 0,5 % aller sequenzierten Bakteriengenome konnten ALOX-ähnliche Sequenzen nachgewiesen werden. Das Bakterium Pseudomonas aeruginosa (PA) exprimiert eine katalytisch aktive ALOX-Isoform und frühere in vitro Experimente haben gezeigt, dass dieses Enzym die Membranen von Erythrozyten zerstört. Im Subprojekt 2 konnten wir allerdings nicht nachweisen, das spezifische ALOX-Produkte in den Erythrozytenmembranen von Patienten nachzuweisen sind, die sich mit PA infiziert haben. Die Evolutionshypothese der Reaktionsspezifität von Säugetier-ALOX15 Orthologen sagt voraus, dass ALOX15 Orthologe von Hominiden Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme sind, während andere Primaten und weniger entwickelte Säugetiere Arachidonsäure 12-lipoxygenierende Enzyme exprimieren. Im Subprojekt 3 haben wir diese Hypothese weitgehend bestätigt und damit die Evolutionshypothese sowie das Triadenkonzept von ALOX15 Orthologen auf eine deutlich breitere experimentelle Basis gestellt. Die ALOX15 und ALOX15B Orthologen von Maus und Mensch unterscheiden sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften gravierend voneinander. Frühere in vitro Mutageneseuntersuchungen hatten jedoch gezeigt, dass geringgradige Veränderungen in der Primärstruktur beider Proteine zu einer Humanisierung ihrer Eigenschaften führen. Ob diese Humanisierung in vivo auch möglich ist, war bislang unklar. In den Subprojekten 4+5 haben wir durch in vivo Mutagenesestudien (Crispr/Cas Strategie) am Alox15 und Alox15b Genort der Maus gezeigt, dass eine funktionelle Humanisierung beider Enzyme möglich ist und dass die erzeugten knock-in Mäuse funktionelle Auffälligkeiten (Wachstumsretardierung, dysfunktionelles erythropoetisches System) aufweisen, wenn sie mit ausgekreuzten Wildtypkontrolltieren verglichen wurden. Da ALOX15 und ALOX15B bei der Pathogenese der Entzündungsreaktion und bei der Blutgerinnung bedeutsam zu sein scheinen, haben wir in den Subprojekten 6+7 untersucht, ob die Humanisierung der Reaktionsspezifität der murinen Alox15 und Alox15b Veränderungen der Empfindlichkeit der Tiere in zwei unabhängigen Entzündungsmodellen induziert. Dabei wurde festgestellt, dass die Humanisierung der Alox15b zu einer Verstärkung der Entzündungsreaktion im DSS-Kolitismodell führt. Die Humanisierung der Alox15 schützt hingegen die Tiere vor der Ausbildung von Entzündungssymptomen. Dieser Schutzeffekt kann jedoch nicht auf eine verstärkte Biosynthese von anti-inflammatorischen bzw. pro-resolutorischen Lipidmediatoren zurückgeführt werden. Im Entzündungsmodell des CFA-induzierten Pfotenödems hatte die Humanisierung der Alox15 keinen Einfluss auf das Entzündungsgeschehen, während Alox15b knock-in Mäuse geschützt waren. Da in früheren Untersuchungen darüber berichtet wurde, dass eine systemische Inaktivierung des Alox15 Gens eine Verringerung der Blutgerinnung induziert, haben wir Alox15-/- Mäuse sowie die von uns erzeugten Alox15-KI Tiere in einem Blutungsmodell getestet (Subprojekt 8). Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den genmanipulierten Tieren und entsprechenden Wildtypmäusen nachgewiesen werden.

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