Molecular basis of TRPC4 and TRPC5 channel activation

• Applicant: Dr. Ursula Storch
• Subject Area: Pharmacology
• Term: from 2018 to 2022
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 406028471

• Final Report Year: 2023

Final Report Abstract

Das Ziel dieses Forschungsprojekts war die Untersuchung des Aktivierungsmechanismus von TRPC4- und TRPC5-Kanälen auf der molekularen Ebene. Im Rahmen dieses Forschungsprojekts wurde die Methode des intramolekularen dynamischen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers (FRET) eingesetzt, um Konformationsänderungen an Transmembranproteinen zu detektieren. Als FRET-Donor diente ein türkis fluoreszierendes Protein und als FRET-Akzeptor der gelb fluoreszierende, arsenische Helixbinder FlAsH, der an einer zuvor eingefügten Tetracysteinbindestelle binden kann. Mittels dieser Methode konnten aktive Konformationen sowohl an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren als auch an TRPC6-Kanälen charakterisiert werden. Zur biophysikalischen Charakterisierung von TRPC-Kanälen wurden elektrophysiologische Patch-Clamp-Messungen in der Ganzzellkonfiguration durchgeführt. Zur quantitativen Analyse von Strom-Spannungsbeziehungen entwickelten wir eine neue Methode: Mittels der sogenannten „normalized slope conductance" konnten Unterschiede zwischen den verschiedenen TRPC-Kanalströmen identifiziert und quantifiziert werden. Es zeigte sich, dass verschiedene Stimuli unterschiedliche Kurvenverläufe hervorrufen, was auf unterschiedliche Kanalkonformationen schließen lässt. Es wurden außerdem lichtschaltbare Diacylglycerol (DAG)-Derivate als Hochpräzisionspharmaka eingesetzt, die mit der Präzision von Licht an- und ausgeschaltet werden können. Durch die Verwendung dieser lichtschaltbaren DAG-Derivate konnten zum ersten Mal die Aktivierungs-, Deaktivierungs- und Inaktivierungskinetiken von TRPC-Kanalströmen exakt bestimmt werden ohne störende Ein- und Auswaschartefakte, die bei der Applikation von Badlösungen üblicherweise auftreten. Der Naturstoff (-)-Englerin A ist ein potenter und selektiver TRPC4- und TRPC5-Kanalaktivator, der zytotoxisch auf diverse Krebszelllinien wirkt. Beim Testen von neuen, potentiellen (-)-Englerin A-Mimetika konnte ein neuer TRPC4-Kanal-Inhibitor identifiziert werden. Um potentielle Bindestellen für (-)-Englerin A bzw. für DAG zu identifizieren, wurden computergestützte Dockinganalysen durchgeführt. Durch anschließende Aminosäureaustausche im Bereich der putativen Bindestellen sollten die potentiellen Bindestellen charakterisiert werden. Wir konnten Kanalregionen identifizieren, die eine Bedeutung für die Bindung und/oder für die Signaltransduktion haben könnten. Die Untersuchungen hierzu sind noch nicht abgeschlossen. TRPC4- und TRPC5-Kanäle sind in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus geraten als neue Zielstrukturen für Pharmaka, unter anderem zur Behandlung von psychischen Erkrankungen und Nierenerkrankungen. Ein tieferes Verständnis des Aktivierungsmechanismus dieser Kanäle trägt dazu bei, in Zukunft neue und potente Pharmaka mit präzisen Wirkmechanismen zu entwickeln.

Publications

• Emerging Roles of Diacylglycerol-Sensitive TRPC4/5 Channels. Cells, 7(11), 218.
  Mederos, y Schnitzler Michael; Gudermann, Thomas & Storch, Ursula
  
• Helix 8 is the essential structural motif of mechanosensitive GPCRs. Nature Communications, 10(1).
  Erdogmus, Serap; Storch, Ursula; Danner, Laura; Becker, Jasmin; Winter, Michaela; Ziegler, Nicole; Wirth, Angela; Offermanns, Stefan; Hoffmann, Carsten; Gudermann, Thomas & Mederos, y Schnitzler Michael
  
• Small Fluorescein Arsenical Hairpin–Based Förster Resonance Energy Transfer Analysis Reveals Changes in Amino- to Carboxyl-Terminal Interactions upon OAG Activation of Classical Transient Receptor Potential 6. Molecular Pharmacology, 96(1), 90-98.
  Fiedler, Susanne; Storch, Ursula; Erdogmus, Serap; Gudermann, Thomas; Mederos, y Schnitzler Michael & Dietrich, Alexander
  
• Shape Similarity by Fractal Dimensionality: An Application in the de novo Design of (−)‐Englerin A Mimetics. ChemMedChem, 15(7), 566-570.
  Friedrich, Lukas; Byrne, Ryan; Treder, Aaron; Singh, Inderjeet; Bauer, Christoph; Gudermann, Thomas; Mederos, y Schnitzler Michael; Storch, Ursula & Schneider, Gisbert
  
• A diacylglycerol photoswitching protocol for studying TRPC channel functions in mammalian cells and tissue slices. STAR Protocols, 2(2), 100527.
  Leinders-Zufall, Trese; Storch, Ursula; Mederos, y Schnitzler Michael; Ojha, Navin K.; Koike, Kohei; Gudermann, Thomas & Zufall, Frank
  
• A greasy business: Identification of a diacylglycerol binding site in human TRPC5 channels by cryo-EM. Cell Calcium, 97, 102414.
  Storch, Ursula; Mederos, y Schnitzler Michael & Gudermann, Thomas
  
• The normalized slope conductance as a tool for quantitative analysis of current-voltage relations. Biophysical Journal, 121(8), 1435-1448.
  Hermann, Christian; Treder, Aaron; Näher, Marius; Geiseler, Roman; Gudermann, Thomas; Mederos, y Schnitzler Michael & Storch, Ursula