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Drosophila nephrocytes as a model system to identify novel therapies for focal segmental glomerulosclerosis

Subject Area Nephrology
Term from 2018 to 2022
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 407240209
 
Final Report Year 2023

Final Report Abstract

Genetische Veränderungen liegen zu einem hoch relevanten Anteil der chronischen Nierenkrankheit zugrunde. Das histologische Bild bei hoher Proteinurie ist oftmals durch eine fokal-segmentale Glomerulosklerose (FSGS) gekennzeichnet. Die FSGS ist eine der häufigeren glomerulären Erkrankungsformen, welche durch ganz verschiedene Ursachen ausgelöst werden, deren gemeinsamer Faktor jedoch ein Verlust an Podozyten ist. Die Heterogenität der FSGS macht eine Wirkstoffentwicklung schwierig, was insbesondere durch das Fehlen einer Schlitzmembran in Zellkultursystemen aggraviert wird. Das Drosophila-Modell verfügt mit den Nephrozyten über eine podozyten-ähnliche Zelle, die eine funktionale und molekular konservierte Schlitzmembran ausbildet. Ein Wirkstoffscreening mit lebenden Tieren bietet die Möglichkeit neuartige und komplexe Wirkmechanismen zu identifizieren. Wir konnten in diesem Tiermodell eine transgene Screeningplattform etablieren, welche die Endozytose einer sekretorischen Form des EGFP-Proteins in Nephrozyten als Korrelat der Nephrozytenfunktion dieser als endozytotische Speicherniere fungierenden Zellen verwendet. Wir verwendeten die so generierte transgene Linie in Verbindung mit einer Überexpression der Rho-GTPase Rac1 als Hintergrund für einen kleineren Wirkstoffscreen. Die Überexpression von Rac1 wurde gewählt, da eine durch vermehrte Aktivität dieser Rho- GTPase gestörte Aktinregulation bei verschiedenen genetischen Formen der FSGS eine Rolle spielt. Durch Untersuchung von 100 Wirkstoffen, die für andere Erkrankungen bereits zugelassen wurden, konnten wir eine Substanz identifizieren, welche die reduzierte Nephrozytenfunktion bei Rac1-Überexpression wieder steigert und die gestörte Architektur der Schlitzmembranen verbessert. Eine Erforschung des zugrundeliegenden Wirkmechanismus bis hin zu einem möglichen therapeutischen Einsatz in der Zukunft wird umfangreiche weitere Untersuchungen erfordern. Dennoch zeigt sich hier bereits das große Potential des Modells für die Wirkstoffforschung, um dringend benötigte Therapiemöglichkeiten bei der genetisch bedingter FSGS zu identifizieren. Wir untersuchten zusätzliche Aspekte zu genetischer FSGS im Projektablauf, zunächst die Rolle des Gens TBC1D8B. Hier konnten wir hemizygote Varianten dieses X-chromosomalen Gens bei 5 Familien mit früh beginnendem, isoliertem nephrotischem Syndrom und vorwiegend FSGS im histologischen Bild identifizieren. Die entsprechenden DNA-Varianten waren extrem selten und kodierten für Aminosäuren in der Proteinsequenz, welche in der Evolution gut konserviert sind. Um die Varianten in TBC1D8B vor diesem Hintergrund als Ursache der Nierenerkrankung zu bestätigen, führten wir funktionelle Untersuchungen durch. Unsere Ergebnisse in kultivierten Zellen weisen auf eine Funktion von TBC1D8B als Inhibitor von RAB11 hin. Diese Rab-GTPase fungiert als Regulator der endozytotischen Recyclings. Wir beobachteten weiterhin eine Protein-Protein-Interaktion und Kolokalisierung von TBC1D8B mit dem Schlitzmembranprotein Nephrin in immortalisierten Zellen. Dies weist auf eine Funktion innerhalb des vesikulären Transports von Nephrin hin. Die Interaktion mit Nephrin war reduziert durch die DNA-Varianten der Patienten, was auf einen gestörten vesikulären Transport von Nephrin als Pathomechanismus hinweist. Dies wird untermauert durch unsere Untersuchungen im Drosophila-Modell, wo sich eine Fehllokalisierung des Schlitzmembranproteins nach Verlust von TBC1D8B zeigte. Insgesamt bestätigen diese Erkenntnisse eine Rolle von TBC1D8B als neues Krankheitsgen bei FSGS und stellen einen Bezug des endozytotischen Recyclings zur Funktion der glomerulären Filtrationsbarriere her. Wir konnten weiterhin das Podozytenmodell der Nephrozyten erfolgreich zur Bestätigung von Kandidaten bei einer genomweiten Assoziationsstudie bzgl. Albuminurie einsetzen, was den Wert dieses Modells auch bei komplexen genetischen Erkrankungen zeigt. Schließlich führten wir zur Erforschung des Zusammenhangs zwischen Autophagie und Podoztenfunktion Untersuchungen in Nephrozyten durch, wo wir eine verminderte Dichte der Schlitzmembranen beobachteten, was wir auf vermehrte autophagozytotische Aktivität zurückführen konnten. Dieser neue Zusammenhang weist auf eine mögliche Rolle der Autophagozytose im Nephrintransport hin. Insgesamt konnten wir somit wichtige Einblicke in verschiedene Aspekte der genetisch bedingt FSGS und der Podozytenbiologie gewinnen.

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