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Partikelstabilisierte Adsorptive Blasenseparation getaggter Enzyme – Ein neuer Weg zu effizientem Downstream Processing?

Fachliche Zuordnung Bioverfahrenstechnik
Förderung Förderung von 2019 bis 2023
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 407649267
 
Erstellungsjahr 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Enzyme haben sich zu wichtigen biotechnologischen Werkzeugen entwickelt, ihr volles Potenzial als Katalysatoren wird jedoch bei weitem noch nicht ausgeschöpft. Dies hängt unter anderem damit zusammen, dass Methoden zur aktivitätserhaltenden und gleichzeitig kosteneffizienten Gewinnung von Enzymen aus Wachstumsmedien oder Rohextrakten biologischer Produzenten fehlen. Einen attraktiven Lösungsansatz für dieses Problem bietet das Verfahren der Schaumfraktionierung. Dabei werden Blasen in Lösungen, die Proteine enthalten, eingebracht. Die Proteine adsorbieren selektiv an den Blasenoberflächen und die aufsteigenden Blasen bilden einen Schaum, der abgeschöpft, verflüssigt und weiterverarbeitet wird. Bei der Anwendung der Schaumfraktionierung auf Enzyme, bewirkt die übliche Enzyme haben sich zu wichtigen biotechnologischen Werkzeugen entwickelt, ihr volles Potenzial als Katalysatoren wird jedoch bei weitem noch nicht ausgeschöpft. Dies hängt unter anderem damit zusammen, dass Methoden zur aktivitätserhaltenden und gleichzeitig kosteneffizienten Gewinnung von Enzymen aus Wachstumsmedien oder Rohextrakten biologischer Produzenten fehlen. Einen attraktiven Lösungsansatz für dieses Problem bietet das Verfahren der Schaumfraktionierung. Dabei werden Blasen in Lösungen, die Proteine enthalten, eingebracht. Die Proteine adsorbieren selektiv an den Blasenoberflächen und die aufsteigenden Blasen bilden einen Schaum, der abgeschöpft, verflüssigt und weiterverarbeitet wird. Bei der Anwendung der Schaumfraktionierung auf Enzyme, bewirkt die übliche Verwendung von Tensiden und/oder die direkte Adsorption des Enzyms an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche jedoch meist einen starken Verlust der katalytischen Aktivität. In unserem Projekt verfolgen wir den Ansatz, diese Probleme durch die Anlagerung eines molekularen Tags an das Zielenzym zu überwinden, der die Adsorptionsrate der Zielenzyme an die Blasen erhöht und den direkten Kontakt zwischen dem aktiven Teil des Enzyms und der Grenzfläche verringert. Vielversprechender Weise war die Einführung eines molekularen Tags allein bereits ausreichend, um einen Schaum mit geeigneter Stabilität für die Fraktionierung zu erzeugen (Krause et al., 2022). Wir fusionierten zunächst das große, oberflächenaktive Protein Ranaspumin-2 (Rsn-2) mit β-Lactamase (Bla), wodurch sowohl sowohl die tensidfreie Bildung eines stabilen Schaums als auch die gezielte Anreicherung des Enzyms unter Beibehaltung der katalytischen Aktivität ermöglicht wurde. Im nächsten Schritt fusionierten wir eine Reihe alternativer Proteine mit Bla und bewerteten ihre Auswirkungen auf die Enzymaktivität und auf die Schaumflotation. Ein Problem war, dass die meisten der fusionierten Tags in Wasser unlöslich waren. Wir lösten dieses Problem durch die Einführung des Spy-Systems, d. h. wir stellten Bla, fusioniert mit SpyTag (SpyT), und F-Tags, fusioniert mit SpyCatcher (SpyC), zunächst separat her und verknüpften dann die beiden Proteine kovalent durch Bildung einer Isopeptidbindung zwischen SpyT und SpyC. Auf diese Weise konnten wir das Enzym aus der Lösung abtrennen, wobei die enzymatische Aktivität weitgehend erhalten blieb. Anhand weiterer Enzyme, konkret Penicillinacylase G und einer Formiatdehydrogenase, konnten wir die Übertragbarkeite des Ansatzes demonstrieren. Parallel dazu entwickelten wir eine numerische Simulation des Schaumfraktionierungs-prozesses, indem wir die instationäre Drainagegleichung im Proteinschaum lösten. Wir führten auch Flow-on-Bubble-Experimente durch, um die Proteinadsorption an den aufsteigenden Blasen in der Zelle zu untersuchen. Die Simulationsergebnisse halfen uns bei der Optimierung des Prozesses im Hinblick auf die Menge und Reinheit des Proteins. Außerdem entwarfen wir eine erweiterte Schaumfraktionierungszelle, um die löslichen Verunreinigungen aus dem Proteinschaum durch Zugabe von Waschwasser zu entfernen. Diese Zelle wurde erfolgreich für die Reinigung getaggter Bla aus einer EGFP-Proteinlösung eingesetzt.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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