Rationales Verständnis von in vitro Evolution durch strukturelle Prinzipien – Implikationen für die DNA-Erkennung von Sequenz-spezifischen Rekombinasen.

• Antragstellerin: Professorin Dr. María Teresa Pisabarro
• Fachliche Zuordnung: Bioinformatik und Theoretische Biologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 408106607

Jüngste Fortschritte in Genom-Editing haben unsere Fähigkeit, DNA präzise zu manipulieren, verbessert. Die einzigartigen Eigenschaften ortsspezifischer Rekombinasen (SSRs), die DNA mit Nucleotidpräzision schneiden und verbinden, können für eine präzise Genommanipulation genutzt werden. Ein wichtiger Schritt zur Erweiterung der Verwendung von SSRs im anspruchsvollen Genom-Engineering besteht in der Erkennung vordefinierter Zielstellen. Das Anpassen von SSRs, sodass sie vordefinierte Zielsequenzen erkennen, ist jedoch nicht einfach.In der Tat sind durch substratgebundene in-vitro-Evolutionsmethoden medizinisch relevante jüngst SSRs hergestellt worden. Diese Techniken haben den Vorteil, dass sie sich nicht auf bereits bestehendes Wissen stützen. Allerdings sind sie mühsam und bieten kein wirkliches Verständnis der Selektivität. Die Entwicklung einer maßgeschneiderten hohen Biospezifität erfordert ein gutes Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen, die das System von Interesse bestimmen. Es ist die inhärente Komplexität der Protein-DNA-Erkennung, die die SSR-Selektivität kontrolliert. Somit kann strukturelles Wissen verwendet werden, um SSRs Spezifität zu rationalisieren und vorherzusagen. Wir haben gezeigt, dass strukturbasierte in silico-Ansätze in Kombination mit in vitro-Evolution zum Verständnis von SSRs Spezifität beitragen kann.In diesem Projekt werden wir Strukturelle Bioinformatik Techniken anwenden, um am Beispiel der Brec1-Rekombinase wichtige Aspekte der SSR-Erkennungsspezifität zu entschlüsseln. Brec1 erkennt eine Sequenz (loxBTR) in den „long-terminal-repeats“ der Mehrzahl klinisch-relevanter HIV-1-Stämme und ist damit in der Lage, dass integrierte Provirus aus infizierten Zellen spezifisch herausschneiden zu können (Karpinski et al. Nat. Biotech. 2016). Erste Analysen der Brec1 Evolutions-Daten im Vergleich zu anderen SSRs lieferte bereits wertvolle Informationen über Mutationshotspots, die besonders untersucht werden sollen. Wir werden molekulare Modellierungs- und Simulationstechniken verwenden, um atomare Protein-DNA-Modelle zu erstellen und ihre strukturellen und dynamischen Eigenschaften einschließlich Grenzflächenhydratation untersuchen. In einer umfassenden systematischen und vergleichenden Analyse mit Brec/loxBTR Wildtyp, Varianten und anderen SSRs werden wir Profile für ihre natürliche/veränderte DNA-Erkennung erstellen. Wir erwarten, dass diese umfassende Analyse der molekularen Evolution der SSRs ein Verständnis der Grundlagen für die Zielstellenspezifität von SSRs liefert, und damit die Erzeugung von neuen Enzymen mit maßgeschneiderten Eigenschaften zu beschleunigen. Rational entworfene SSRs werden experimentell getestet und verwendet, um die Vorhersagefähigkeiten unserer theoretischen Modelle zu verbessern. Das Ergebnis dieser Arbeit wird auch für die Entwicklung anderer Proteine-Engineering Ansätze von Nutzen sein und somit einen wichtigen Beitrag zum Fortschritt für die Biotechnologie und Biomedizin leisten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Kooperationspartner: Professor Dr. Frank Buchholz