Die funktionelle Rolle der ARTEMIS-DNA-PKcs Interaktion bei der Reparatur von physiologischen und pathologischen DNA Doppelstrangbrüchen

• Antragsteller: Dr. Klaus Schwarz
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Immunologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 408613301

Die Nuklease ARTEMIS und die Proteinkinase DNA-PKcs sind wichtige Proteine für die Reparatur von physiologischen und pathologischen DNA Doppelstrangbrüchen (DSB). Sie sind Teil des “canonical Non-Homologous End-Joining” (cNHEJ) DNA Reparaturwegs. ARTEMIS und DNA-PKcs interagieren und bilden zusammen die hairpin-öffnende Aktivität, welche für die V(D)J Rekombination und damit für die Entwicklung von B und T Lymphozyten des adaptiven Immunsystems essentiell ist. Verlust eines der beiden Proteine resultiert in einem strahlen-sensitiven schweren kombinierten Immundefekt (RS-SCID), eine Erkrankung die unbehandelt innerhalb des ersten Lebensjahrs zum Tod führt. ARTEMIS Mutationen sind eine häufige Ursache für RS-SCID, hingegen sind nur wenige Patienten bekannt, die eine Mutation in DNA-PKcs tragen. Der Phänotyp eines Patienten, der den krankheits-verursachenden Aminosäureaustausch pLeu3062Arg in DNA-PKcs trägt, ähnelt ARTEMIS-null Patienten. In vitro wird ARTEMIS durch DNA-PKcs phosphoryliert und das hairpin-opening ist DNA-PKcs-abhängig. Bis heute ist die in vivo Bedeutung der ARTEMIS-DNA-PKcs Interaktion und der DNA-PKcs-abhängigen Phosphorylierung unklar. Mutationen in den wichtigsten Phosphorylierungsstellen im ARTEMIS C-Terminus haben weder Einfluss auf die V(D)J Rekombination noch auf ARTEMIS-abhängige DSB Reparatur. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass der Aminosäureaustausch pLeu3062Arg in DNA-PKcs die Interaktion mit ARTEMIS beeinträchtigt, dies könnte ursächlich für die RS-SCID Erkrankung sein. In diesem Projekt werden wir mit einem genetischen und einem biochemischen Ansatz untersuchen ob die ARTEMIS-DNA-PKcs Interaktion eine notwendige Voraussetzung für V(D)J Rekombination und für die Reparatur von IR-induzierten DSB ist. Mittels CRISPR/Cas9 Technologie werden wir spezifische Mutationen in den Protein-Protein Interaktionsdomänen der endogenen Proteine einführen und anschließend deren Effekt auf V(D)J Rekombination und DNA Reparatur untersuchen. In einem zweiten Ansatz werden wir mittels Peptiden, die aus den Protein-Protein Interaktionsdomänen stammen, ARTEMIS Funktion in vivo inhibieren. DNA-PKcs ist ein multifunktionelles Protein, das in diversen Signaltransduktionswegen beteiligt ist. Mit den zwei unabhängigen experimentellen Strategien können wir in vivo die funktionelle Bedeutung der ARTEMIS-DNA-PKcs Interaktion für das cNHEJ endgültig evaluieren. Die Ergebnisse des biochemischen Ansatzes können in Zukunft als Ausgangspunkt für die Entwicklung spezifischer Peptide oder Peptidomimetika genutzt werden, um über die spezifische Protein-Protein Interaktion die ARTEMIS-abhängige Reparatur von DSB in distinkten Tumoren gezielt zu inhibieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen