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Multiple Verknüpfungen mittels Sortase-vermittelter Ligation am Beispiel von Protein-Polymer-Konjugaten

Antragsteller Dr. Ulrich Glebe
Fachliche Zuordnung Polymermaterialien
Förderung Förderung von 2018 bis 2022
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 414977640
 
Erstellungsjahr 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Sortasen sind Enzyme aus der Zellwand Gram-positiver Bakterien. Sortase A bindet Proteine mit der C-terminalen Erkennungssequenz –LPXTG an die Zellwände der Bakterien. Die Sortasevermittelte Ligation (SML, für Engl. Sortase-mediated ligation) hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einer vielfältig genutzten Methode zur ortsspezifischen Modifikation von Proteinen entwickelt. Unser Review aus der Anfangszeit dieses Projekts gibt einen Überblick über die Anbindung von kleinen Molekülen, Lipiden, Zuckern und Polymeren sowie der Ligation zweier Protein-Fragmente und der Immobilisierung von Proteinen auf Oberflächen und an lebende Bakterienzellen. Die Verknüpfung zweier Makromoleküle durch SML ist jedoch eine Herausforderung, u.a. weil es sich um einen Gleichgewichtsprozess handelt. Im Rahmen des Projekts wurden Peptid-Polymer Konjugate synthetisiert, die durch Sortasevermittelte Ligation einerseits miteinander zu Block-Copolymeren und andererseits mit Proteinen zu Protein-Polymer Konjugaten umgesetzt wurden. Die ortsspezifische Polymerkonjugation durch SML ist für therapeutische Proteine besonders interessant, da sich die Modifizierung der Termini oft nur geringfügig auf die Struktur und Funktion eines Proteins auswirkt und so ein hoher Erhalt der Funktionalität der meisten Proteine erreicht werden kann. Außerdem können verschiedene Polymere, die als Alternativen zu PEG im biomedizinischen Bereich diskutiert werden, konjugiert werden. Zwei Arten an Peptid-Polymer Konjugaten können für SML eingesetzt werden: einerseits mit dem Polymer an den N-Terminus eines Peptids mit der SrtA Erkennungssequenz LPXTG (X: beliebige Aminosäure außer Prolin) gebunden und andererseits an den C-Terminus eines Oligoglycins, welche als Nukleophil in Sortase-Reaktionen fungieren. Die Ausarbeitung der Synthese dieser zwei Arten an Peptid-Polymer Konjugaten hat einen deutlich längeren Zeitraum des Projekts in Anspruch genommen als vorher erwartet, konnte aber durch Festphasenpeptidsynthese und XPI- RAFT Polymerisation erfolgreich realisiert werden. Aus der SML der Peptid-Polymer Konjugate zu Block-Copolymeren ließ sich schlussfolgern, dass sich – wie erwartet – Polymerlänge und –architektur limitierend auf die Effizienz der SML auswirken. Anschließend wurden ortsspezifische Protein-Polymer Konjugate mit dem Nanobody Ty1 hergestellt. Ty1 bindet an die Spike-Proteine von SARS-CoV-2 und kann die Viren so neutralisieren. Abschließend haben wir die Synthese von neuen Polymerkonstrukten durchgeführt, die mono- und multivalente Konjugate mit dem Nanobody Ty1 ergeben sollen. Die monovalenten Konjugate enthalten ein Polymer pro Protein. Bei multivalenten Konjugaten werden mehrere Proteine über ein Polymer verknüpft. Dies ist für den Nanobody Ty1 besonders interessant, da die Spike-Proteine von SARS-CoV-2 drei Bindestellen haben und durch multivalente Konjugate noch effizienter inhibiert werden könnten. Zukünftige Arbeiten werden sich der ortsspezifischen Konjugation verschiedener PEG-Alternativen an Proteine widmen, um den Effekt der verschiedenen Polymere auf Proteine vergleichen zu können.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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