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The impact of ubiquitous ions on the photodynamic inactivation of bacteria (PIB)

Subject Area Dermatology
Term from 2018 to 2023
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 415812443
 
Final Report Year 2022

Final Report Abstract

Seit Jahren wird die photodynamische Inaktivierung von Bakterien (PIB) erforscht und es wurden verschiedenste Photosensibilisatoren im Labor in vitro erfolgreich getestet. In Zeiten zunehmender Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika oder Antiseptika könnte PIB somit eine wertvolle Ergänzung im Kampf gegen pathogene Erreger darstellen. Erste Untersuchungen im Rahmen des Transfers der PIB in reale Umgebungsbedingungen hatten aber gezeigt, dass außerhalb des Labors (z.B. auf menschlicher Hautoberfläche, im Trinkwasser) verschiedene Stoffe wie allgegenwärtige Ionen die Effizienz von PIB erheblich vermindern können. Hier setzte das Projekt der Einfluss von allgegenwärtigen Ionen auf die photodynamische Inaktivierung von Bakterien (PIB) an. Im ersten Arbeitspaket zeigte die Spektroskopie, dass die untersuchten Photosensibilisatoren wie SAPYR, Methylenblau und mit kleinen Einschränkungen auch TMPyP (Vertreter häufig verwendeter Substanzklassen) trotz hoher Ionenkonzentrationen eine hohe photochemische Stabilität besitzen. Die Spektren der getesteten Flavine weisen dagegen, insbesondere in Gegenwart von Phosphat und Carbonat Ionen, auf erhebliche Veränderungen der Molekülstruktur hin. Bei den untersuchten Photosensibilisatoren spielt der Singulettsauerstoff eine zentrale Rolle. Aufgrund technischer Probleme mit dem vorhandenen Detektionssystem erfolgte der Nachweis von Singulettsauerstoff zunächst mit dem bekannten DPBF assay. Dieser zeigte, dass die verwendeten Photosensibilisatoren auch in Anwesenheit verschiedener Ionen stabil Singulettsauerstoff erzeugten, nur bei den Flavinen wurde nahezu kein Singulettsauerstoff erzeugt. Im Laufe des Projekts konnte dann doch Singulettsauerstoff mittels seiner Lumineszenz gemessen werden. Dies ergab, dass die Ionen keinen nennenswerten, negativen Einfluss auf die Lebensdauer von Singulettsauerstoff haben, also keine Quencher sind. Für den Einsatz von PIB an der Haut sollte ein Lösungsmittel mit höherer Viskosität als Wasser verwendet werden. Deswegen wurde zusätzlich die Lebensdauer von Singulettsauerstoff in einer wässrigen Lösung von Hydroxyethyl-zellulose (Hydrogel) bestimmt. In diesem Hydrogel zeigte sich kein Quenchen, somit kann dieses Hydrogel im weiteren Verlauf für PIB auf der Haut eingesetzt werden. Die folgenden Experimente in Suspensionen mit unterschiedlichen Bakterien ergaben, dass PIB auch in Anwesenheit der meisten Ionen eine hohe Effizienz gegenüber verschiedenen, bekannten Pathogenen mit bis zu 6 Log10 CFU/mL hatte. Die bereits gezeigte photochemische Instabilität von Flavinen führte aber bei bestimmten Ionen zu einer erheblichen Reduktion der PIB Effizienz. Überraschend kam dazu, dass zweiwertige Ionen (Magnesium, Calcium) die PIB Effizienz auch bei anderen Photosensibilisatoren (SAPYR, Methylenblau, TMPyP) reduzieren können. Offensichtlich blockieren diese Ionen das Attachement der Photosensibilisatoren an die Zellhülle der Bakterien. Porine könnten eine Rolle für die Aufnahme von Photosensibilisatoren in den periplasmatischen Raum von Gram-negativen Bakterien spielen. Die Ergebnisse im vierten Arbeitspaket zeigten, dass diese Proteine bei den untersuchten Photosensibilisatoren einen unterschiedlich hohen Einfluss auf die PIB Effizienz haben. Für eine weitere Aufklärung dieser Mechanismen bedarf es umfangreicher, molekularbiologischer Methoden, welche in einem zukünftigen Projekt eingesetzt werden sollen. Da im fünften Arbeitspaket gezeigt werden konnte, dass der Chelator Citrat durch Komplexierung von störenden Ionen (Magnesium, Calcium) die Effektivität der PIB deutlich steigern kann, wurde diese Substanz dann auch bei der Entkeimung von Haut ex vivo eingesetzt (sechstes Arbeitspaket). Das Hydrogel mit dem Photosensibilisator SAPYR und Citrat kann die Keimlast auf der Haut (S. aureus, P. aeruginosa) mit bis zu 4,8 Log10 CFU/mL reduzieren. Die Experimente im Arbeitspaket sieben mussten pandemiebedingt geändert werden. Bereits Stress-adaptierte Bakterien von menschlicher Haut, z.B. aus der Gattung Pantoea, zeigten eine reduzierte Sensitivität gegenüber PIB. Der Effekt ist offensichtlich auf der Anwesenheit von quenchenden Carotenoiden zurückzuführen. Wurden die Gene zur Carotenoid-Biosynthese aus der Gattung Pantoea in E. coli eingebracht, erhöhte sich auch deren Toleranz gegenüber PIB. Im Nachgang zum Projekt werden die Mechanismen in diesen und weiteren Organismen untersucht. Fazit In diesem Projekt wurde PIB im Hinblick auf eine Anwendung unter realen Bedingungen Schritt für Schritt optimiert, so dass bedeutende Pathogene wie S. aureus auf der Haut innerhalb weniger Minuten sehr effizient inaktiviert werden können. Die Effizienz von PIB ist chemischen Desinfektionsmitteln vergleichbar, ohne die Nachteile der dabei verwendeten Chemikalien in Kauf nehmen zu müssen. Auf Basis der Ergebnisse aus diesem Projekt können nun klinische Studien zur Dekolonisierung der Haut bzw. zur Bekämpfung von Hautinfektionen unternommen werden.

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