Analyse der PKA-abhängigen synaptischen Plastizität in Moosfaser-Synapsen des Hippocampus mithilfe neuartiger optogenetischer Werkzeuge
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Es wird angenommen, dass die synaptische Plastizität einer der wichtigsten zellulären Prozesse ist, die dem Lernen und dem Gedächtnis zugrunde liegen. In mehreren Synapsen, vor allem in den Moosfasern des Hippocampus (MF), wurde nachgewiesen, dass ein Anstieg des präsynaptischen cAMP eine entscheidende Komponente bei der Erhöhung der Neurotransmitterfreisetzung während der Langzeitpotenzierung (LTP) des MF ist. Bisher wurden cAMP-abhängige synaptische Prozesse durch den Einsatz pharmakologischer Wirkstoffe wie Forskolin erreicht, um den cAMP-Spiegel zu erhöhen, aber ihre Wirkung ist weder spezifisch noch reversibel. Um diese Hindernisse zu überwinden, verwenden wir bPAC, eine photoaktivierbare Adenylyl-Zyklase aus dem Meeresbakterium Beggiatoa spec., die eine lichtabhängige cAMP-Erhöhung vermittelt. Ihr klarer Vorteil ist die Fähigkeit, ihre schnelle und reversible Aktivierung zellspezifisch zu exprimieren. Um dieses neuartige optogenetische Werkzeug zu nutzen, suchen wir nach einem einzelnen floreszierenden Protein (FP) cAMP-Sensor, der die Verfolgung der cAMP-Konzentration und -Dynamik in Neuronen nach bPAC-Aktivierung ermöglicht. In dieser Arbeit haben wir die Implementierung von dynamischen cAMP-Messungen in PC12-Zellen und in Neuronen gezeigt, indem wir Pink Flamindo, Flamindo2 und R-FlincA, drei verschiedene Single-FP cAMP-Indikatoren, getestet haben und entsprechend ihrer Leistung mit Pink Flamindo und Flamindo2 weitergearbeitet haben. Als Nächstes haben wir Pink Flamindo und bPAC in Neuronen koexprimiert und die cAMP-Konzentration und -Dynamik nach Aktivierung von bPAC verfolgt. Wir aktivierten bPAC in Neuronen durch blaues Licht und verfolgten die Fluoreszenz von Pink Flamindo vor, während und nach der Aktivierung von bPAC. Wir kalibrierten die bPAC-Aktivierung in kortikalen Zellen, gefolgt von unterschiedlich langen Stimulationen mit blauem Polychrom-Licht oder von Stimulationen mit verschiedenen blauen Laser-Intensitäten, begleitet von unterschiedlichen Konzentrationen von cAMP-Analoga. Um die Reaktion von Pink Flamindo auf jede bPAC-Stimulation oder cAMP-Analoganwendung zu quantifizieren, haben wir drei Merkmale der ansteigenden Phase nach jeder Manipulation gemessen: die Veränderung der FI, die Zeit bis zum Spitzenwert der FI und die Steigung der ansteigenden Phase mit Hilfe von original geschriebenen Python-Skripten. Außerdem fehlt immer noch eine genaue Korrelation zwischen der cAMP-Dynamik und der synaptischen Potenzierung. Um diese Herausforderung zu meistern, haben wir versucht, die cAMP-Dynamik nach einem elektrischen Hochfrequenz-Stimulationsprotokoll (HFS) zu untersuchen. Wir haben einen Dual-Imaging-Aufbau für die Aufzeichnung von cAMP parallel zur Ca2+-Bildgebung implementiert; Neuronen wurden mit Pink Flamindo bzw. GCaMP6s- Sensoren kotransduziert. Leider mussten wir feststellen, dass die Fluoreszenz von Pink Flamindo wahrscheinlich durch die Kalzium- oder Spannungsabhängigkeit beeinflusst wird, was zu einem Artefakt in unseren Messungen führt, und wir konnten noch keine genaue Korrelation feststellen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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An engineered membrane-bound guanylyl cyclase with light-switchable activity. BMC Biology, 19(1).
Tian, Yuehui; Nagel, Georg & Gao, Shiqiang
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Effect of SARS-CoV-2 proteins on vascular permeability. eLife, 10.
Rauti, Rossana; Shahoha, Meishar; Leichtmann-Bardoogo, Yael; Nasser, Rami; Paz, Eyal; Tamir, Rina; Miller, Victoria; Babich, Tal; Shaked, Kfir; Ehrlich, Avner; Ioannidis, Konstantinos; Nahmias, Yaakov; Sharan, Roded; Ashery, Uri & Maoz, Ben Meir
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Hyperbaric oxygen therapy alleviates vascular dysfunction and amyloid burden in an Alzheimer’s disease mouse model and in elderly patients. Aging, 13(17), 20935-20961.
Shapira, Ronit; Gdalyahu, Amos; Gottfried, Irit; Sasson, Efrat; Hadanny, Amir; Efrati, Shai; Blinder, Pablo & Ashery, Uri
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Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature, 597(7875), 245-249.
Zhang, Stephen X.; Lutas, Andrew; Yang, Shang; Diaz, Adriana; Fluhr, Hugo; Nagel, Georg; Gao, Shiqiang & Andermann, Mark L.
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miR-128 as a Regulator of Synaptic Properties in 5xFAD Mice Hippocampal Neurons. Journal of Molecular Neuroscience, 71(12), 2593-2607.
Shvarts-Serebro, Inna; Sheinin, Anton; Gottfried, Irit; Adler, Lior; Schottlender, Nofar; Ashery, Uri & Barak, Boaz
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PACmn for improved optogenetic control of intracellular cAMP. BMC Biology, 19(1).
Yang, Shang; Constantin, Oana M.; Sachidanandan, Divya; Hofmann, Hannes; Kunz, Tobias C.; Kozjak-Pavlovic, Vera; Oertner, Thomas G.; Nagel, Georg; Kittel, Robert J.; Gee, Christine E. & Gao, Shiqiang
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Characterization and Modification of Light-Sensitive Phosphodiesterases from Choanoflagellates. Biomolecules, 12(1), 88.
Tian, Yuehui; Yang, Shang; Nagel, Georg & Gao, Shiqiang
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Hippocampal cAMP-dependent synaptic potentiation, ERK-dependent immediate-early gene activation, and context-dependent fear conditioning in mice are linked through dependence on the guanine nucleotide exchange factor RapGEF2. Cold Spring Harbor Laboratory.
Jiang, Sunny Zhihong; Shahoha, Meishar; Tejeda, Hugo A.; Ashery, Uri & Eiden, Lee E.
