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Mitochondrial diseases - long read genome and transcriptome sequencing in cases unresolved after short-read genomics

Subject Area Human Genetics
Molecular Biology and Physiology of Neurons and Glial Cells
Term from 2019 to 2023
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 418081722
 
Final Report Year 2023

Final Report Abstract

Trotz Fortschritten in der klinischen Implementierung genomweiter Sequenzieransätze, wie bspw. der Exomsequenzierung, bleibt bei einem erheblichen Anteil von Patienten mit einer seltenen, genetisch bedingten Erkrankung die molekulare Ursache ungeklärt. Mögliche Erklärungen sind u.a. unser unvollständiges Wissen um Zusammenhänge von DNA-Varianten bzw. Genen mit klinischen Merkmalen, aber auch technische Einschränkungen beim Nachweis krankheitsursächlicher Veränderungen. Im Rahmen dieses Forschungsprojekts sollte ein potentieller diagnostischer Mehrwert der sogenannten Long-read Sequenzierung exemplarisch bei schweren neuropädiatrischen und neurologischen Krankheitsbildern untersucht werden. Bei den eingeschlossenen Probanden konnte in einer zuvor durchgeführten Genomsequenzierung mit der Short-read Technologie keine wahrscheinliche Krankheitsursache nachgewiesen werden. Als Modell für etwaige Folgestudien standen aus einer Hautstanze etablierte Zelllinien (Fibroblasten) zur Verfügung. Die experimentellen Sequenzierarbeiten konnten wie geplant mit der Methode von Oxford Nanopores Technologies (ONT) durchgeführt werden. Über die Laufzeit des Projekts wurden technische Neuerungen bei der Sequenzierchemie implementiert und die Protokolle für eine maximale Datengenerierung optimiert. So konnten zuletzt mit einer sogenannten „flow cell“ ausreichend Daten für ein komplettes humanes Genom mit einer durchschnittlichen 35-fachen Abdeckung generiert werden. Nach der Etablierung der primären bioinformatischen Aufarbeitung der Daten (mapping der Sequenzen auf das Referenzgenom, Detektion von DNA-Varianten) wurde auch die bioinformatische Qualitätssicherung und Sequenzierstatistik in eine open source Analyse-pipeline integriert. Die Auswertung der Daten zeigte eine deutliche Verbesserung der Rohdaten über die Projektlaufzeit. Über genetisch umfassend charakterisierte Referenzproben („genome in a bottle“) wurde die diagnostische Sensitivität und Spezifität der Long-read Genomsequenzierung bestimmt. Hierbei zeigte sich für Punktmutationen vergleichbare Werte wie bei der bisher genutzten Short-read Technologie. Bei den kleinen Insertionen und Deletionen („Indels“) zeigte sich wie erwartet eine etwas geringere Sensitivität und Spezifität, die für die kodierenden genomischen Regionen allerdings annähernd vergleichbar war. Bei den Strukturvarianten und Repeatexpansionen fanden sich deutliche Vorteile bei der Long-read Sequenzierung. Auch krankheitsassoziierte Änderungen im Methylierungsstatus konnten bei entsprechenden Positivkontrollen nachgewiesen werden. Auf Grundlage dieser experimentellen und bioinformatischen Vorarbeiten wurde die Long-read Genomsequenzierung von der Deutschen Akkreditierungsstelle (DAkkS) nach der DIN EN ISO 15189 zur diagnostischen Testung zugelassen und steht damit zur weiteren Abklärung von Patienten/innen mit bislang ungeklärten, wahrscheinlich genetisch bedingten Krankheitsbildern in der Routineversorgung zur Verfügung. Im Rahmen dieser Projektförderung konnten neben funktionellen Studien zur Etablierung neuer Krankheitsgene exemplarisch auch die verbesserte Detektion komplexer genomischer Veränderungen mittels Long-read Sequenzierung aufgezeigt werden. Beispielhaft ist für den diagnostischen Mehrwert ist hier die Aufklärung einer seltenen Form der Ataxie zu nennen, deren genetische Ursache mit den bisherigen Technologien nicht nachgewiesen werden konnte. Der potentielle klinische Nutzen für weitere Seltene Erkrankungen wird derzeit in einer Kooperation verschiedener universitärer Standort (Aachen, Berlin, Hannover, Tübingen) mit ONT im Rahmen einer nationalen Initiative zur klinischen Implementierung der Long-read Genomsequenzierung („lonGER“) bei 1000 Probanden über eine Laufzeit von zwei Jahren prospektiv untersucht.

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