Functional characterization of a novel evolutionarily conserved inositol hexakisphosphate kinase in mammalian cells
Final Report Abstract
Die Phosphorylierung des sechswertigen cyclischen Alkohols myo-Inositol führt zu einer Vielzahl von Signalmolekülen, die als Inositolpolyphosphate (InsPs) bekannt sind. Dazu gehören der berühmte Calcium-Freisetzungsfaktor Ins(1,4,5)P3 sowie das vollständig phosphorylierte InsP6, das auch als Phytinsäure bekannt ist und das am häufigsten vorkommende InsP in Eukaryoten ist. InsP6 dient als wichtiger zellulärer Botenstoff, indem es verschiedene fundamentale Aspekte der Zellphysiologie in Eukaryoten steuert, darunter mRNA-Export, Pathogenabwehr und Phosphathomöostase. Darüber hinaus dient InsP6 auch als Vorläufer weiterer Signalmoleküle, den Inositol-Pyrophospahten (PP-InsPs), die für die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen in Eukaryonten entscheidend sind. Um die molekulare Basis der InsP- und PP-InsP-Wirkung zu verstehen, ist es von größter Bedeutung, zu entschlüsseln, wie InsP6 und seine Derivate in der Zelle synthetisiert werden. In der Bäckerhefe wird die InsP6-Synthese durch die kombinatorische Aktivität einer Gruppe von InsP-Kinasen vermittelt, die das aus Lipiden entstehende InsP3 phosphorylieren. Dies ist jedoch kein universeller Biosyntheseweg, da in sozialen Amöben InsP6 unabhängig von der Aktivität der Phospholipase C (PLC) synthetisiert wird. Es bleibt unklar, welcher Weg für die InsP6-Produktion in Säugetierzellen genutzt wird. Ist es der PLC-abhängige Lipidweg oder ein 'zytosolischer Weg', der die InsP 6-Synthese in Metazoen vermittelt, oder beides? In diesem Projekt kombinierten wir genetische, zellbiologische und metabolische Experimente und untersuchten den relativen Beitrag von ITPK1 und IPMK für den zytosolischen Weg, der zur InsP 6- Synthese führt. ITPK1 ist eine konservierte InsP-Kinase, die in allen Eukaryoten vorkommt. Insbesondere charakterisierten wir unabhängige HEK293T ITPK1-/- Linien mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und starker Anionenaustausch- Chromatographie (SAX-HPLC). Unsere Ergebnisse zeigten, dass ITPK1-/- -defiziente Zellen ein kompromittiertes Wildtyp-Niveau der InsP6-Produktion aufweisen. Wir validierten diese Ergebnisse durch ITPK1-/- Knockout in der menschlichen Kolonkarzinom-Zelllinie HCT116. Um den Beitrag von IPMK zur höheren InsP-Synthese in Säugetierzellen aufzuklären, generierten wir einen Knockout in der HCT116-Zelllinie mit CRISPR/Cas9. Wir erhielten unabhängige klonale Linien, und die Analyse der IPMK- /- Linien ergab eine 90%ige Reduktion des InsP 6-Gehalts mittels PAGE- und SAX-HPLC-Analyse. Überraschenderweise konnten wir keine spezifische Akkumulation von Ins(1,4,5)P3 feststellen, wie es aufgrund des zuvor untersuchten Hefemodells zu erwarten war. Dies deutet darauf hin, dass der Metabolismus höherer InsPs im Säugetiersystem komplexer ist und der Hefe-InsP-Stoffwechselweg nicht einfach auf das Säugetiermodell übertragen werden kann. Unser Experiment legt nahe, dass die durch Phosphatmangel induzierten InsP6-Gehalte von ITPK1 und IPMK abhängig sind. Derzeit generieren wir ITPK-/- IPMK-/- doppel KO-Linien, um weitere Einblicke in die Synthese höhere InsPs zu erhalten. Darüber hinaus untersuchen wir die physiologischen Konsequenzen von Zellen mit veränderter InsP 6-Homöostase. Außerdem konnte ich mit verschiedenen Gruppen zusammenarbeiten, was zu zwei veröffentlichten Arbeiten führte. Letztendlich haben die Ergebnisse der Studie die Komplexität des InsP-Stoffwechsel im Säugetiersystem aufgezeigt und bieten neue Möglichkeiten, den Beitrag von InsP6 von dem anderer InsPs, z. B. PP-InsPs, bei der Regulierung verschiedener physiologischer Prozesse zu unterscheiden.
Publications
- ITPK1 Mediates the Lipid-Independent Synthesis of Inositol Phosphates Controlled by Metabolism. Proc Natl Acad Sci USA. 2019 116(49):24551-24561
Desfougères Y, Wilson MSC, Laha D, Miller G, Saiardi A
(See online at https://doi.org/10.1073/pnas.1911431116) - Inositol phosphate kinases in the eukaryote landscape. Advances in Biological Regulation 2021 79: 100782
Laha D, Portela-Torres P, Desfougères Y, Saiardi A
(See online at https://doi.org/10.1016/j.jbior.2020.100782) - ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls phosphate signaling in Arabidopsis. Molecular Plant 2021
Riemer E, Qiu D, Laha D, Harmel RK, Gaugler P, Gaugler V, Frei M, Hajirezaei M, Laha NP, Krusenbaum L, Schneider R, Saiardi A, Fiedler D, Jessen HJ, Schaaf G, Giehl RFH
(See online at https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.07.011)
