In vitro-Biosynthese von Hydroxamat- und β-Lakton-haltigen Pharmakophoren natürlicher Proteasinhibitoren
Biochemie
Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Proteasen haben sich als Zielmoleküle in der Thearpie verschiedener Krankheiten etabliert, z. B. Myelom, Diabetes, Bluthochdruck und Virusinfektionen. Insbesondere die Entwicklung von Wirkstoffkandidaten für Proteasehemmer wurde stark von Naturstoffen inspiriert. Diese wirken häufig, indem sie mit spezifischen reaktiven Struktureinheiten, z. B. elektrophilen Epoxyketonen, Aldehyden, β-Lactonen, an Zielenzyme binden oder durch chelatbildende Hydroxamat- Einheiten Metalloproteasen hemmen. Wir haben kürzlich die Biosynthesewege der N-Hydroxyalkylsuccinamsäure enthaltenden Metalloproteasehemmer Actinonin und Matylstatin sowie der 2-Carboxy-3-alkyl-β-lacton enthaltenden Proteasomhemmer Cystargolid und Belactosin identifiziert. In dem von der DFG geförderten Forschungsprojekt haben wir vorgeschlagen, die Bildung dieser Warheads mithilfe von In-vitro-Biochemie und Proteinkristallographie im Detail zu untersuchen. Leider blieb die Untersuchung des Hydroxamsäurewarheads trotz verschiedenster Versuche erfolglos. Hingegen konnten wir wesentliche Fortschritte beim Verständnis der Biosynthese des β-Lacton-Restes von Cystargoliden und Belactosinen erzielen. Wir fanden heraus, dass drei Enzyme an der Bildung dieses Warheads beteiligt sind. Die SAM-abhängige Methyltransferase CysG methyliert 3-Isopropylmalat (3-IPM), um den kryptischen 3-IPM-1-Methylester (Met-3-IPM) zu erzeugen. Dieses Zwischenprodukt wird ATP-abhängig zum β-Lactonmethylester (CysF) cyclisiert und von der Methylesterase CysE weiterverarbeitet, um den β-Lactoncarbonsäure-Baustein zu erzeugen. Wir gehen davon aus, dass CysG als Weichensteller fungiert, der den Primärmetaboliten 3-IPM der Cystargolid-Biosynthese zuordnet und die 1-Carbonsäuregruppe für die folgende Lactonisierung maskiert. Insgesamt haben wir nur fünf spezifische Enzyme als wesentlich für die Bildung von Cystargolid identifiziert: die SAM-abhängige Methyltransferase CysG, die Methylesterase CysE, das ATP-grasp-Enzym CysD und die Adenylierungsenzyme CysC und CysF. In der Belactosinbiosynthese finden wir den gleichen Mechanismus für die Bildung des β-Lacton-Warheads. Hier ist es das CysG-Homolog BelI, das aus 3-sec-Butylmalat ein kryptisches 1-Methylester-Zwischenprodukt erzeugt. Wiederum sind ein Adenylierungsenzym und eine Methylesterase an den nachfolgenden Reaktionen beteiligt. Als nächstes haben wir BelI und CysG durch Proteinkristallographie, Computeranalyse, Mutagenese und Aktivitätstests charakterisiert. Dabei haben wir ein His-His-Asp (HHD)-Motiv in den aktiven Stellen der beiden Enzyme identifiziert, das für die Bindung eines katalytisch aktiven Calciumions entscheidend ist. Dieser konservierte, zweiwertige, metallabhängige Mechanismus unterscheidet BelI und CysG von zuvor charakterisierten O-Methyltransferasen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Structure of Staphylococcus aureus ClpP Bound to the Covalent Active‐Site Inhibitor Cystargolide A. Angewandte Chemie International Edition, 63(3).
Illigmann, Astrid; Vielberg, Marie‐Theres; Lakemeyer, Markus; Wolf, Felix; Dema, Taulant; Stange, Patrik; Kuttenlochner, Wolfgang; Liebhart, Elisa; Kulik, Andreas; Staudt, Nicole D.; Malik, Imran; Grond, Stephanie; Sieber, Stephan A.; Kaysser, Leonard; Groll, Michael & Brötz‐Oesterhelt, Heike
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Characterization of the cystargolide biosynthetic gene cluster and functional analysis of the methyltransferase CysG. Journal of Biological Chemistry, 300(1), 105507.
Beller, Patrick; Fink, Phillipp; Wolf, Felix; Männle, Daniel; Helmle, Irina; Kuttenlochner, Wolfgang; Unterfrauner, Daniel; Engelbrecht, Alicia; Staudt, Nicole D.; Kulik, Andreas; Groll, Michael; Gross, Harald & Kaysser, Leonard
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Deciphering the SAM- and metal-dependent mechanism of O-methyltransferases in cystargolide and belactosin biosynthesis: A structure–activity relationship study. Journal of Biological Chemistry, 300(9), 107646.
Kuttenlochner, Wolfgang; Beller, Patrick; Kaysser, Leonard & Groll, Michael
