Contributions of claudin-2 to host defense during initial and persistent colonization by enteric pathogens.
Final Report Abstract
Im Rahmen des Forschungsstipendiums sollte die Rolle von Claudin-2 im intestinalen Epithel während der initialen sowie der fortbestehenden Kolonisation von Darmpathogenen weiter untersucht werden. Zur Erreichung des Ziels sollten in vitro und in vivo Experimente durchgeführt werden. Während der Einarbeitungsphase zu Beginn wurde ich den Mitarbeitern des gastgebenden Forschungslabors vorgestellt. Daraufhin wurde mir ein Arbeitsplatz zugewiesen. Die ersten Monate waren geprägt von Einarbeitung, Teilnahme an Informationsveranstaltungen und Kursen für Zugangsberechtigungen für beispielsweise die BSL2 Einrichtung. Das erste Teilprojekt befasste sich mit der Rolle von Claudin-2 während der initialen Kolonisation und Bindung von Citrobacter rodentium an das intestinale Epithel in vivo und in vitro. Ein wesentlicher Fallstrick hier war, dass das dafür wesentliche Protokoll nicht etabliert war. Das Durchführen der Experimente war nicht ohne Weitere möglich. Von dem gastgebenden Labor wurde eine unmittelbare Durchführbarkeit dieser Versuche kommuniziert, da die notwendigen Materialen, Claudin-2 KO, Claudin-2 TG sowie WT Mäuse vorhanden seien sowie die Methodik etabliert sei. Entgegen der im Antrag fürs Forschungsstipendium erwähnten möglichen Fallstricke wurde klar, dass es kein ausführliches Protokoll zur Durchführung dieser Experimente gab. Die Erstautorin des publizierten Papers war per Email nur nach einer Verzögerung von mehreren Wochen zu erreichen. Deshalb musste ich das Protokoll zur Infektion von Mäusen mit C. rodentium erneut etablieren. Somit hatte ich bis zum ersten Lockdown an der Etablierung eines Protokolls gearbeitet. Durch Pilotexperimente konnte ich ein reproduzierbares Infektionsmodell etablieren und die bereits publizierten Unterschieden von Cldn2 KO und Cld2 TG Mäusen reproduzieren. Hier erwarte ich noch eine Publikation gemeinsam mit dem gastgebenden Labor. Da die Methodik zur Infektion nicht etabliert war habe ich mich parallel zu dieser Arbeit an einem anderen Projekt mitgearbeitet und die Rolle von Claudin-2 im Rahmen von immun-vermittelter Colitis untersucht. Noch bevor dem ersten Lockdown konnte ich wesentlich zu diesem Projekt beitragen, aus dieser Arbeit ist eine Ko-Autorenschaft im Rahmen des Claudin-2 Projekts entstanden (publiziert 2020, siehe Publikationsliste). Parallel dazu begann ich mit der Durchführung von in vitro Experimenten. Die ersten in vitro Experimente machte ich mit MDCK-Zellen sowie Caco-Zellen. Zur Infektion dieser Zellen wurde EPEC genutzt. Hier konnte ich mittels Konfokalmikroskopie die Infektion von MDCK Zellen mit EPEC nachweisen. Hieraus ist eine Ko-Autorenschaft entstanden (publiziert 2021, siehe Publikationsliste). Aufgrund der Corona Pandemie wurde in Boston ein Lockdown beschlossen, der es erforderlich machte, die Labore zu schließen. Im Zuge dessen war es drei Hauptverantwortlichen seitens der Security gestattet, für wenige Stunden pro Tag im Labor nach dem rechten zu schauen, Experimente waren nicht gestattet und die Zugänge der anderen Labormitglieder, mich eingeschlossen, wurden für die Zeit des Lockdowns gesperrt. Die Mauskolonien unseres Labors wurden deutlich reduziert und auf wenige Mäuse zur Erhaltung der Mauslinien reduziert. Diese verständlichen und notwendigen Maßnahmen im Rahmen der Corona Pandemie führten nicht nur zu einem Zeitverlust, sondern auch dazu, dass insgesamt von dem wissenschaftlichen Konzept im Verlauf abgewichen werden musste. In der Zeit des Lockdowns aufgrund der Corona Pandemie konnte ich die Zeit für die Mitarbeit am Manuskript sowie Auswertung von Ergebnissen für die Publikation nutzen. Zudem wollte das gastgebende Labor seine Homepage erneuern. Im Zuge wurde in laborinternen Videokonferenzen über den inhaltlichen Aufbau der neuen Homepage entschieden und Aufgaben verteilt, u.a. musste alte Protokolle überarbeitet werden und neue Protokolle geschrieben werden. Ich hatte Protokolle über die Konfokalmikroskopie, C. rodentium Experimente, Gebrauch des plate readers, Gebrauch der Imaris Software usw. geschrieben. Im Zuge der Lockerung des Lockdowns durften kleinere Experimente durchgeführt werden. Hier wurde ich seitens des gasgebenden Labors mit der Intravitalmikroskopie von Mäusedarm beauftragt. Hier musste das Protokoll etabliert werden. Die Mäuse wurden entsprechend der IACUC Auflagen behandelt. Der Darm wurde präpariert und mittels Elektrokauter eröffnet. Der Mäusedarm wurde gereinigt. Den Mäusen wurde Hoechst, zur Anfärbung der Zellkerne, Phalloidin, zur Anfärbung des Aktin, sowie weitere Farbstoffe (Albumin und Dextran zur Färbung der intestinalen Blutgefäße, CoroNa green als Natrium-Indikator) zur Gegenfärbung injiziert.
Publications
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(2020). "Inactivation of paracellular cation-selective claudin-2 channels attenuates immune-mediated experimental colitis in mice." J Clinical Investigation
Raju, Preeti; Shashikanth, Nitesh; Tsai, Pei-Yun; Pongkorpsakol, Pawin; Chanez-Paredes, Sandra; Steinhagen, Peter R.; Kuo, Wei-Ting; Singh, Gurminder; Tsukita, Sachiko & Turner, Jerrold R.
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Establishment of Intestinal Epithelial Cell Monolayers and Their Use in 5Calcium Switch Assay for Assessment of Intestinal Tight Junction Assembly. Jan 2021. Permeability Barrier. Kursad Turksen, Ed. Springer
Pongkorpsakol, Pawin; Satianrapapong, Wilasinee; Wongkrasant, Preedajit; Steinhagen, Peter R.; Tuangkijkul, Nuttha; Pathomthongtaweechai, Nutthapoom & Muanprasat, Chatchai
