Untersuchung der biochemischen Grundlagen der Wirkungsweise von ABERRANT LATERAL ROOT FORMATION4, einem mutmaßlichen Ubiquitylierungstuner
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ubiquitin (Ub)-gesteuerter Proteinabbau ist ein universeller und schaltbarer Prozess, der fast jeden Aspekt der pflanzlichen Entwicklung reguliert. Eine hierarchische Enzymkaskade der Ub-Aktivierung und des Ub-Transfers (E1-E2-E3) ermöglicht eine spezifische Modifizierung (Ubiquitylierung) von Zielproteinen. Modulare Cullin1-RING E3-Ub-Ligasen (SCF-Komplexe) steuern eine Vielzahl biologischer Prozesse und unterliegen einer genauen Abstimmung auf den Ebenen der Bildung von Mutiproteinkomplexen, Rekrutierung von Zielproteinen und des UB-Transfers. Trotz profunder Auswirkungen von Ubiquitylierung auf die Homöostase zellulärer Proteine ist wenig darüber bekannt, wie Katalyse und Regulation von SCF-Komplexen sowie der Ub-Transfer auf Zielproteine auf molekularer Ebene ablaufen. Glomulin (GLMN) in Mammalia und ABERRANT LATERAL ROOT FORMATION4 (ALF4) in Pflanzen ist ein hochkonserviertes Protein, welches generell von nur einer Genkopie kodiert wird. GLMN/ALF4 inhibiert die Aktivität von SCF-Komplexen über die kompetitive Bindung an deren E2-Andockstelle. Die Letalität von glmn/alf4 Knockout-Mutanten sowohl in Mammalia als auch in Pflanzen unterstreichen die essenzielle Rolle der GLMN/ALF4 Funktion. Mutanten der Referenzpflanze Arabidopsis thaliana mit schwache alf4 Allelen sind zwar lebensfähig, zeigen jedoch Wachstumsstörungen, die auf Störungen in der Hormonantwort hinweisen. Wir konnten zeigen, dass in diesen alf4 Mutanten Komponenten von SCF-Komplexen dereguliert sind, wodurch wiederum native SCF-Zielproteine, die im Wildtyp in Reaktion auf Phytohormone ubiquityliert und degradiert werden, stabilisiert werden. Es ist bislang nicht bekannt, wie ALF4 seine inhibitorische Wirkung auf SCF E3-Ub-Ligasen und die Ubiquitylierung von Zielproteinen ausübt. Ziel des hier beantragten Projekts ist es, biochemische und biophysikalische Ansätze zum mechanistischen Verständnis der ALF4-Aktivität zu implementieren. Hierzu soll die ALF4-Funktion für die Ubiquitylierung von SCF-Zielproteinen in vivo und in vitro, sowie das ALF4-regulierte Proteom untersucht werden. Weiterhin soll das ALF4-Interaktionsnetzwerk rekonstruiert werden, um so Einblicke in die Steuerung der ALF4-Aktivität zu gewinnen. Letztendlich werden die Untersuchungen im Rahmen dieses Projektes dazu beitragen, die Assemblierung von SCF-Komplexen und damit den Ubiquitin-vermittelten Proteinabbau besser zu verstehen.
