Molekularer Mechanismus der Interaktion von Hsp90 mit Cochaperonen und Klienten
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die hochkonservierten Hsp90 Chaperone kontrollieren Stabilität und Aktivität vieler essentieller Proteine, einschließlich ca. 60% aller Proteinkinasen, 30% aller E3 Ubiquitinligasen und vieler Transkriptionsfaktoren. Diese Studie hatte zum Ziel, das Verständnis der physiologischen Funktion der beiden Hsp90 Isoformen Hsp90α und Hsp90β im nuklear-zytoplasmatischen Kompartiment der Zellen des Menschen zu vertiefen und deren Regulation durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) systematisch zu untersuchen. Wir entwickelten ein Doxycycline-induzierbares, CRISPRi-basiertes Knock-down System in HeLa Zellen, welches erlaubt, die zelluläre Konzentration jedes der beiden Hsp90 Isoformen separat zu weniger als 5% der normalen Konzentration und beide Hsp90 Isoformen gleichzeitig zu etwa 30% der normalen Konzentration zu reduzieren, bevor die Zellen aufhören sich zu teilen. Die wichtigsten Entdeckungen dieser Studie sind: (1) beide Hsp90 Isoformen sind in der Lage sich gegenseitig zu ersetzen, wenn die Herunterregulierung einer Isoform langsam über einen Zeitraum von 5 Tagen passiert, nicht aber, wenn die Reduzierung einer Isoform innerhalb eines Tages passiert; (2) die Verwendung Isoform-spezifischer Inhibitoren zeigte, dass die Inhibition von Hsp90 einen toxischen Funktionsgewinn und keinen Funktionsverlust verursacht; (3) zeitaufgelöste Proteomik zeigte, dass die Mehrzahl der Proteine, deren Konzentration reduziert wird, wenn Hsp90 limitierend ist, Proteinklienten sind, die mit Hsp90 während der de novo Synthese interagieren und nicht Klienten, die konstitutiv an Hsp90 binden. Der erste Klient, welcher bei reduzierten Hsp90 Konzentrationen versagt, ist Cdk1, was zum Anhalten des Zellzyklus in der S Phase und dem G2/M-Übergang führt. Hochdurchsatz-Phosphoproteomik zeigte, dass Hsp90α und Hsp90β des Menschen an 74 und 66 Stellen phosphoryliert werden, von denen jedoch nur sehr wenige genauer untersucht wurden. Wir explorierten die Eignung des Hefe-Modellsystems, Schlüsselregulatoraminosäuren in Hsp90α zu identifizieren. Die Ersetzung dreier Tyrosine in der N-terminalen Nukleotidbindedomäne von Hsp90α des Menschen durch Glutamat und Phenylalanin individuell oder in Kombination beeinflusste das Wachstum eines Hefestammes, in welchem beide endogene Hsp90- Gene deletiert sind, und unterstützte die Aktivität von sieben verschiedenen Hsp90 Klienten unterschiedlich. Dies weist darauf hin, dass PTMs die Klientenspezifität von Hsp90 modulieren können. Diese Hypothese wurde in einer zweiten Studie bestärkt, in welche sechs Tyrosin- Phosphorylierungsstellen in der Gelenkregion zwischen Mittel- und C-terminaler Domäne untersucht wurden. Überraschenderweise komplementierte eine phosphomimetische Glutamatvariante das Hefewachstum auf fermentierbarer Kohlenstoffquelle, jedoch nicht nach dem Diauxieübergang und nicht auf nicht-fermentierbarer Kohlenstoffquelle. Um den Molekularen Mechanismus zu eruieren, verwenden wir gegenwärtig unsere HeLa Hsp90 Knock-down-Zelllinie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Modification of regulatory tyrosines biases human Hsp90α for interaction with cochaperones and clients.
Huo, Yuantao; Karnawat, Rishabh; Liu, Lixia; Knieß, Robert A.; Gross, Maike; Chen, Xuemei & Mayer, Matthias P.
