Einfluss von In vivo RNA-Protein-Interaktion auf chromatin-assocziierte RNA

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dorothee Staiger
• Fachliche Zuordnung: Zell- und Entwicklungsbiologie der Pflanzen ; Biochemie und Biophysik der Pflanzen ; Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung seit 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 422321065

RNAs sind mit einer Vielzahl RNA-bindender Proteine (RBPs) assoziiert, die ihre Prozessierung und Funktion koordinieren. Das durch die innere Uhr kontrollierte Arabidopsis thaliana GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7 (AtGRP7) spielt eine Rolle im circadianen System, bei der Reaktion auf Temperaturveränderungen, der Pathogenabwehr und der Blühzeitpunktkontrolle. Auf molekularer Ebene kontrolliert es alternatives Spleißen, die Prozessierung einiger Mikro-RNA Vorläufer und long noncoding RNAs, sowie RNA Stabilität. Mittels Individual-nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) haben wir genomweit Zieltranskripte für AtGRP7 sowie die entsprechenden Bindestellen bestimmt. Der Vergleich mit Transkripten, die in AtGRP7-übereprimierenden Pflanzen oder atgrp7 Mutanten aberrante Expressionsmuster zeigen, identifizierte Transkripte, die durch Bindung von AtGRP7 auf der Ebene von alternativem Spleißen oder RNA Stabilität reguliert werden. Es ist heute bekannt, dass Entscheidungen über Prozessierungsschritte wie alternatives Spleißen an nativer RNA getroffen werden. Um den Einfluss von AtGRP7 auf die Prozessierung der gebundenen Transkripte präziser zu bestimmen, werden wir eine subzelluläre Fraktionierung von Pflanzen, die AtGRP7-GFP exprimieren, vornehmen und iCLIP an chromatin-assoziierter RNA mittels unseres plant iCLIP2 Protokolls durchführen. Um die targets unabhängig zu validieren, werden wir HyperTRIBE etablieren. Dazu wird AtGRP7 mit ADAR fusioniert, so dass Bindung von AtGRP7 an Zieltranskripte zu A-I Editierung in der näheren Umgebung führt, die anhand der A-G Mutationen durch RNA-seq erkannt werden. Um toxische Effekte von hyperaktivem ADAR zu vermeiden, werden wir ein induzierbares System entwickeln. Parallel werden wir das Chromatin-assoziierte Transkriptom in AtGRP7-Überexprimieren, atgrp7 Mutanten und Wildtyp vergleichen, um Transkripte zu identifizieren, deren Prozessierung am Chromatin unter Kontrolle von AtGRP7 steht. Ein Vergleich der Bindungsdaten und Transkriptomdaten wird Aufschluss über Transkripte geben, deren frühe Prozessierungsschritte durch direkte Bindung von AtGRP7 reguliert werden. Die Relevanz dieser Regulation wird durch Spleiß-Reportergene und Mutation der Bindungsstellen untersucht. Insgesamt werden wir neue Einsichten in Prozesse erhalten, die durch AtGRP7 auf kotranskriptioneller Ebene kontrolliert werden. Die Verwendung von heterogenem Ausgangmaterial mit verschiedenen Zelltypen zur Bestimmung regulatorischer Netzwerke, die durch RBPs kontrolliert werden, beeinträchtigt derzeit die Korrelation von Bindungsdaten mit Expressionsdaten in Pflanzen. Wir werden ein zellspezifisches HyperTRIBE System etablieren, um AtGRP7 Bindung in einzelnen Zellen bestimmen zu können und somit die physiologische Relevanz exakter definieren zu können. Insgesamt werden die entwickelten Methoden und ihre Anwendung von genereller Relevanz für pflanzliche RBPs und die Identifizierung ihrer regulatorischen Netzwerke sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen