Lange nicht-codierende RNAs als Quelle krebsspezifischer Polypeptide: Potenzielle Biomarker und Modulatoren der Krebsentstehung

• Antragsteller: Privatdozent Doan Duy Tran, Ph.D., seit 7/2021
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 422417499

Der zurzeit explodierende Zuwachs an Informationen aus der Genomforschung, der Bioinformatik und der modernen Genetik leitet gerade einen grundlegenden Wandel in der Krebsforschung ein und eröffnet neue Möglichkeiten zur Entdeckung krebszellspezifischer Biomarker. Ribo-Seq-Daten zeigen, dass 40% der in menschlichen Zellen exprimierten langen nicht-codierenden (lnc) und Pseudogen-RNAs trans¬latiert werden. Die durchschnittliche Größe der von lncRNAs stammenden „verborgenen (hidden) Peptide“ beträgt zwar nur 43 Aminosäuren, da die Expression der lncRNAs aber zelltyp- und sogar krebszellspezifisch ist, könnten diese Peptide krebsspezifische Antigene darstellen und überdies eine biologische Funktion ausüben. Das hepatozellulären Karzinom (HCC) entwickelt sich meist aus Leberzirrhose nach Virusinfektion, chronischem Alkoholmissbrauch oder metabolischem Syndrom. Einige Tumore entstehen möglicherweise auch nach maligner Transformation hepatozellulärer Adenome (HCA). Die Entschlüsselung der genetischen Veränderungen bei der HCC-Entwicklung wird ausschlaggebend dafür sein, Biomarker für Risikogruppen zu identifizieren und gezielte Therapieansätze deutlich zu verbessern.Wir konnten zeigen, dass in HCC die lncRNA Linc00176 in Exon 2 gespleißt wird und diese HCC-spezifische Spleißvariante zu einem 189-Aminosäuren langen Polypeptid translatiert wird. Um weitere „verborgene Peptide“ zu identifizieren, analysierten wir Ribo-Seq-Daten der HCC-Zelllinie HepG2 und fanden 113 potenzielle HepG2-spezifische „verborgene Peptide“. Wir wollen nun Folgendes untersuchen:1) Mittels Nanopore-Technologie sollen neue lncRNAs und Spleißvarianten von lncRNAs identifiziert werden. Diese Sequenziertechnik erlaubt durch extrem lange Reads (bis 50 kb) das Auffinden bisher unerkannter Sequenzen.2) Wenn wir lncRNA-Kandidaten an Ribosomen detektieren können, werden wir die Stabilität der potenziellen “verborgenen Peptide” durch in vitro Transkription/Translation und durch Expression der Peptide mit FLAG- oder Myc-Tag in Zellen untersuchen. 3) Wir werden Antikörper gegen „verborgene Peptide“ herstellen und ihre endogene Expression über Immunoblot und Immunfärbungen nachweisen. 4) Aus HepG2-Zellen werden wir kleine Peptide isolieren und sequenzieren. Dazu werden wir mit den Ribo-Seq-Daten eine Referenz-Datenbank für die Proteomanalyse für „verborgene Peptide“ erstellen.5) Zur Untersuchung eines durch „verborgene Peptide“ und/oder die lncRNA verursachten Phänotyps werden wir siRNAs gegen die lncRNAs in HCC-Zellen exprimieren und Start-Codons im potenziellen Leserahmen der lncRNAs zur Ausschaltung der Proteinexpression mit CRISPR/Cas9 zu Stopp-Codons editieren. 6) Schließlich werden wir mit den Antikörpern aus 3) Patientenmaterial daraufhin untersuchen, ob die „verborgenen Peptide“ in HCC, HCA, Leberzirrhose oder normaler Leber exprimiert werden und als Biomarker dienlich sein könnten. Später soll geklärt werden, ob die Peptide als Antigene präsentiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Ehemalige Antragstellerin: Professorin Dr. Teruko Tamura-Niemann, bis 7/2021 (†)