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Projekt
Entwicklung von neuen Methoden zur optischen Spannungsmessung zur Studie neuronaler Plastizität im Säugetier in-vivo
Antragsteller
Dr. Robert Prevedel
Fachliche Zuordnung
Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
Förderung
Förderung von 2019 bis 2024
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 425902099
In den modernen Neurowissenschaften werden sowohl geeignete optische Spannungsindikatoren als auch hochschnelle Mikroskopie Methoden dringend gebraucht. Trotz Fortschritte in dieser Richtung gibt es zurzeit kein System welches die erforderlich hohen Ansprüche an Sensitivität, Zeitauflösung als auch Signal zu Rausch Verhältnis kombinieren kann. In der Indikatoren Entwicklung, zum Beispiel, sind die synthetischen (VSDs) als auch genetisch kodier baren (GECIs) Spannungsindikatoren durch unspezifischen Hintergrund und langsame Kinetik begrenzt. In der Mikroskopie hingegen muss man einen Kompromiss eingehen und kann nicht gleichzeitig ein großes Volumen und viele Zellen erfassen und diese auch noch schnell genug abbilden. In diesem Antrag wollen wir beide Mängel beseitigen und sowohl 1) neue, hybride Indikatoren generieren welche die Vorzüge von VSDs und GECIs vereinen; 2) neue Zwei-Photonen Mikroskopie Methoden entwickeln um damit Spannungdynamiken mit hoher zeitlicher Auflösung in der lebenden Maus abzubilden; und 3) mit diesen beiden Technologien eine zentrale Frage in der sensorischen Biologie adressieren, nämlich wie harmlose Reize zu einem schmerzhaften Eindruck werden können.Um neue hybride Spannungsindikatoren zu entwickeln wird die Heppenstall Gruppe aufbauend auf früheren Arbeiten ein Peptid/Protein System benutzen, um das spannungssensitive Fluorophor Nile Red an die exrazelluläre Zellmembran zu binden und dieses für hohe Sensitivität zu optimieren. Danach werden Strategien entwickelt um Nile Red an das opsin-basierende GEVI, Ace2N, anzubinden. Durch elektrochromatischen FRET erwarten wir das die resultierende hybride Probe hohe Sensitivität und schnelle Kinetik aufweisen wird. Auf der Mikroskopie Seite wird die Prevedel Gruppe aufbauend auf frühere Arbeiten ein ultra-schnelles Zwei-Photon Mikroskop entwickeln welches optische Signale der entwickelten Proben mit Millisekunden Auflösung über große Bereiche abbilden kann. Dafür wird eine auf der Lichtformung basierende Methode durch räumliches und zeitliches Multiplexen verbessert, sodass diese 500x500µm große neuronale Gewebe mit kHz Bildraten aufnehmen kann.Um schlussendlich unsere neuen Technologien in vivo zu validieren und bewerten zu können, werden wir komplexe Gewebe im Rückenmark der Maus in vivo untersuchen. Dabei werden wir studieren wie die neuronale Plastizität im dorsalen Horn mit der Hypersensitivität gegenüber leichter Berührung zusammenhängt. Mit der optogenetischen Aktivierung von Mechanorezeptoren in der Haut und der gleichzeitigen Messung der neuronalen Dynamik mit Hilfe von Zwei-Photonen Mikroskopie im dorsalen Horn wollen wir verstehen wie sich die Netzwerke im Rückenmark unter pathologischen Bedingungen verändern und so den Übergang von harmlosen zu schädlichem Schmerz nach Verletzungen beeinflussen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
