Ko-translationale Mechanismen der Proteinfaltung untersucht auf Einzelmolekülniveau
Biochemie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die ko-translationale Proteinfaltung ist an die Proteinsynthese gekoppelt und wird durch räumliche Begrenzungen und Wechselwirkungen, sowohl innerhalb als auch außerhalb des ribosomalen Tunnels bestimmt. Bis heute ist nicht vollständig geklärt, wie die Synthese (d. h. die Verlängerung der Polypeptidkette) und die Faltung zusammenwirken, um ein funktionsfähiges Protein zu produzieren. In unseren bisherigen Arbeiten haben wir das nötige methodische Wissen und die Erfahrung erlangt, um kraft- und fluoreszenzbasierte Einzelmolekültechniken zusammenzubringen und somit ein tieferes Verständnis dieses Zusammenspiels zu erhalten. Zunächst haben wir eine Studie durchgeführt, welche das Ziel hatte die ko-translationale Faltung einer kleinen Proteindomäne (ADR1a) innerhalb des ribosomalen Tunnels durch die Kombination von smFRET und einer optischen Pinzette besser zu verstehen. Hier scheinen elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der naszierenden Kette und dem Ribosom zu einer beschleunigten Faltung und zu einer Stabilisierung der Domäne beizutragen. Als nächstes haben wir versucht diesen Ansatz auf die Untersuchung eines größeren Proteins anzuwenden, nämlich des zwei-Domänen Proteins Phosphoglycerat- Kinase aus der Hefe (yPGK). Zu diesem Zweck wurden zunächst Faltungsübergänge des gesamten Proteins mit Hilfe von smFRET charakterisiert und die Eigenschaften der Übergänge im Hinblick auf die zugrundeliegende Domänentopologie analysiert. Der Ansatz, zellfrei synthetisierte, zweifach farbstoffmarkierte Polypeptidketten zu verwenden, um smFRET- Studien zur Charakterisierung naszierender yPGK-Ketten unterschiedlicher Länge, die verschiedenen Stadien der Synthese und Faltung entsprechen, durchzuführen, konnte bisher nicht realisiert werden. Ein zusätzlicher Ansatz, der Kryo-EM mit Einzelpartikelanalyse von Ribosomen gebundenen naszierenden Ketten Komplexen (RNCs) verwendet, zeigte jedoch erste vielversprechende Ergebnisse. Schließlich wurde der Versuch unternommen, die Synthese und Faltung von yPGK unter Krafteinwirkung in Echtzeit zu verfolgen (derselbe Ansatz, der mit ADRa1 durchgeführt wurde), konnte aber aufgrund von Problemen mit den zellfreien synthetisierten yPGK-Ketten nicht erfolgreich abgeschlossen werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The ribosome modulates folding inside the ribosomal exit tunnel. Communications Biology, 4(1).
Wruck, Florian; Tian, Pengfei; Kudva, Renuka; Best, Robert B.; von Heijne, Gunnar; Tans, Sander J. & Katranidis, Alexandros
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Impact of Molecule Concentration, Diffusion Rates and Surface Passivation on Single-Molecule Fluorescence Studies in Solution. Biomolecules, 12(3), 468.
Yukhnovets, Olessya; Höfig, Henning; Bustorff, Nuno; Katranidis, Alexandros & Fitter, Jörg
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“Snapshots of co-translational multi-domain protein folding”, 66th Annual Meeting of the Biophysical-Society 2022, Biophys. J. 121 (3), 284A-284A
N. Bustorff & A. Katranidis, J. Fitter
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Features of Protein Unfolding Transitions and Their Relation to Domain Topology Probed by Single-Molecule FRET. Biomolecules, 13(9), 1280.
Bustorff, Nuno & Fitter, Jörg
