Molekulare und physiologische Charakterisierung der Differenzierung von Purkinje Zellen zu Beginn der Entwicklung
Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Forschungsprojekt hatte als Zielsetzung die molekulare und elektrophysiologische Charakterisierung von Purkinjezellen in vitro. Wir waren erfolgreich im Etablieren einer Kultur von embryonalen wie auch von jungen postnatalen Mäusen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass sich Zellen die von postnatalen Mäusen isoliert wurden sich ehr wie Zellen in vitro entwickeln. Überraschend war für uns die Schwierigkeit Zellen in vitro zu transfizieren. Über einen sehr langen Zeitraum haben wir jegliche Transfektionsmethode probiert, oft mit dem Ergebnis, dass die Zellen: 1) die Transfektion nicht überlebt haben, 2) die Morphologie der Zellen sich stark verändert hatte oder 3) nicht die Zellen von Interesse transfiziert waren. Als Transfektionsmethode haben wir chemisch, physikalisch, aber auch viral probiert. Viral, sprich Transduktion, konnten wir auch nur mit Adeno-assoziierte Viren (AAV) Erfolge verzeichnen. Letztendlich konnten wir mit antisense oligonukleotiden (ASOs) eine Transfektionsrate von 100 % erzielen. Wir haben diese Methode gewählt, da sich ASOs schnell produzieren lassen und nur eine geringe Menge benötigt wird und sie damit sehr effizient sind. Es war für uns sehr überraschend, dass die Transfektion mit ASOs auf Lipofectamine Basis erfolgreich war, da zuvor der Gebrauch von Lipofectamine und einem Plasmid erfolglos war. Obwohl wir im Ursprünglichen Antrag die Methode „Patch sequencing“ favorisiert hatten um Gene die Unterschiedlich exprimiert sind zu identifizieren konnten wir aus bereits erläuterten Gründen die Methode nicht anwenden. Daher haben wir auf in vivo Daten zurückgegriffen und konnten so 5 Gene auswählen die unterschiedlich exprimiert werden (Zebrin positiv vs negative). Für diese Gene haben wir ASOs herstellen lasse und konnten deren Effizienz bereits and HEK Zellen testen. Da der Durchbruch mit ASOs recht zum Ende des Projekts hinkam, konnten noch nicht alle Gene getestet werden. Diese Arbeit wird nun in der Gruppe von Dr. Schonewille weitergeführt und wir hoffen bald die Daten veröffentlichen zu können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir eine Methode zur Transfektion gefunden haben, die viele Vorteile anderer Methoden gegenüber hat und sich leicht Anwenden lässt. Auch wenn sich das Projekt von der ursprünglichen Idee entfernen musste, haben wir gute Alternativen gefunden und konnten den Grundstein für die weitere Analyse bilden. Aus verschiedenen Ereignissen war das Forschungsprojekt von mehreren Unterbrechungen begleitet und hat für einige Verzögerungen gesorgt und konnte daher noch keine Veröffentlichungen liefern.
