Analyse des prä-tRNA-Spleißens auf unterschiedlichen Ebenen: Von Molekülen zu Zellen

• Antragsteller: Dr. Simon Trowitzsch
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 428858078

Transfer-RNAs (tRNAs) spielen eine entscheidende Rolle in der Proteinbiosynthese, indem sie an Ribosomen Codons der Boten-RNA (mRNA) in Aminosäuren übersetzen. Die Reifung von prä-tRNAs umfasst die Prozessierung der 5'- und 3'-Enden, die CCA-Addition und die Entfernung von Introns. Die Entfernung der Introns wird durch den tRNA-Spleiß-Endonuklease-Komplex (TSEN) katalysiert; die Ligation der Exons durch den tRNA-Spleiß-Ligase-Komplex (TSL). Der humane TSEN-Komplex interagiert mit der RNA-Kinase CLP1, die paradoxerweise die Exon-Ligation hemmt. Mutationen in TSEN sowie in CLP1 sind mit der neurodegenerativen Erkrankung Pontozerebelläre Hypoplasie (PCH) verbunden. Meine Gruppe hat substanzielle Beiträge zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen TSEN und prä-tRNAs in Hinblick auf PCH geleistet. Trotz dieser Fortschritte in strukturellen und biochemischen Studien bleiben wichtige Fragen zu molekularen Mechanismen der Intron-Entfernung sowie der Exon-Ligation offen. Dieses Projekt zielt darauf ab, ein umfassendes Verständnis des prä-tRNA-Spleißens durch biochemische und strukturbiologische Studien, sowie durch Einzelmolekülexperimente und zelluläre Ansätze zu gewinnen. Hierfür sollen TSEN-CLP1-Wechselwirkungen, die Kinetik der Intron-Entfernung, die konformationellen Dynamiken von TSEN, die Interaktion zwischen TSEN und TSL, sowie die zeitaufgelöste Lokalisation von prä-tRNA-Molekülen und deren Spleißprodukte in menschlichen Zellen analysiert und in Kontext gebracht werden. Über strukturelle und biochemische Studien werden wir die Bindungsmotive zwischen TSEN54 und CLP1 identifizieren und Aufschlüsse über den Einfluss von PCH-Mutationen auf die Komplexbildung und das prä-tRNA-Spleißen geben. Über maßgeschneiderte prä-tRNA-Fluorophor/Quencher-Sonden soll die Kinetik der Intron-Entfernung mittels Fluoreszenzspektroskopie und Einzelmolekül-Bildgebung verfolgt werden. Wir werden strukturelle Momentaufnahmen von prä-tRNA-TSEN-Komplexen über zeitaufgelöste Kryo-EM bestimmen und diese mithilfe von Molekulardynamik-Simulationen konformationellen Übergänge während der Katalyse zuordnen. Über In-vitro-Rekonstitutions-Assays werden wir die Kooperation zwischen TSEN und TSL beim Spleißen beleuchten und strukturelle Einblicke in die Zusammenarbeit von TSEN und TSL über Kryo-EM liefern. Ferner werden wir die prä-tRNA-Prozessierungswege mittels der Fluoreszenz-markierten prä-tRNA-Sonden in lebenden Zellen untersuchen. Zeitaufgelöste konfokale Mikroskopie nach Mikroinjektion soll den nuklearen Export und die Reifungswege von Intron-tragenden prä-tRNAs kartieren, welche über Fraktionierungsexperimente bestätigt werden. Dieses multidisziplinäre Projekt integriert strukturelle, biochemische, biophysikalische und zelluläre Ansätze zur Untersuchung des prä-tRNA-Spleißens. Durch die Aufdeckung neuer regulatorischer Mechanismen wird es substanziell zum Verständnis des zellulären RNA-Stoffwechsels und seiner Störungen bei neurodegenerativen Erkrankungen beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen