Strukturelle und mechanistische Untersuchungen zur prä-tRNA Prozessierung durch die humane tRNA-Spleiß-Endonuklease und deren Einfluss auf neurodegenerative Krankheiten

• Antragsteller: Dr. Simon Trowitzsch
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 428858078

Transfer-RNAs (tRNAs) gehören zu den am häufigsten vorkommenden Molekülen in Zellen aus allen drei Lebensdomänen und sind für die Informationsweitergabe von tRNAs zu Proteinen während der Translation an Ribosomen von zentraler Bedeutung. Neben ihrer kanonischen Rolle während der Proteinbiosynthese erfüllen tRNAs zusätzliche Funktionen als Signalmoleküle bei der Regulation zahlreicher metabolischer und zellulärer Prozesse, als Stresssensoren oder bei tRNA-abhängigen Biosynthesewegen. tRNA-Fragmente wurden als neue Spezies kleiner, nicht kodierender RNAs identifiziert, die zur Translationskontrolle, Genregulation, sowie zu Motorneuron-Erkrankungen beitragen. tRNAs werden als Vorläufermoleküle kodiert, die eine Vielzahl von Modifikationen durchlaufen, einschließlich der Entfernung intronischer Sequenzen. Beim Menschen werden Introns durch die heterotetramere tRNA-Spleiß-Endonuklease (TSEN) entfernt, die mit der RNA-Kinase CLP1 assoziiert. Mutationen in TSEN oder CLP1 führen zur Entwicklung schwerer neurologischer Störungen. Wie diese Mutationen zur Entstehung der Krankheit beitragen ist völlig unklar. Frühere biochemische Studien haben erste funktionelle Aspekte der prä-tRNA-Erkennung und -Spaltung durch TSEN aufgezeigt. Detaillierte Einblicke in die Anordnung der humanen Endonuklease-Untereinheiten und die Substraterkennung bleiben jedoch aufgrund fehlender Strukturen aus. Die Rolle von CLP1 im Prozess des prä-tRNA-Spleißens bleibt rätselhaft. Ich werde grundlegende Fragen zur prä-tRNA-Prozessierung in drei Hauptzielen adressieren. Durch die Bestimmung hochauflösender Strukturen der humanen Endonuklease werden wir einen strukturellen Rahmen für das Verständnis des molekularen Mechanismus des prä-tRNA-Spleißens liefern, die Unterschiede zwischen archaealen und eukaryotischen Systemen erklären, die Rolle von CLP1 entschlüsseln, die Struktur einer Intron-haltigen prä-tRNA aufzeigen, sowie die Auswirkungen von Krankheitsmutationen erklären. Wir werden das prä-tRNA-Spleißen in Einzelzellen bei subzellulärer Auflösung verfolgen, indem wir maßgeschneiderte prä-tRNA-Fluorophor/Quencher-Sonden entwickeln, die über Lokalisierung und Spleißstatus berichten. Wir werden dieses tRNA-Reporter-System in einem zellulären Krankheitsmodell verwenden, um die Konsequenzen von Mutationen auf die Lokalisierung von TSEN-Komponenten, tRNA und des Spleißens zu untersuchen. Darüber hinaus werden uns die prä-tRNA-Sonden erlauben, kinetische Parameter der Intron-Exzision in vitro zu verfolgen. Letztendlich werden wir neue Substrate der humanen prä-tRNA-Endonuklease durch UV-quervernetzende Immunpräzipitation mit Hochdurchsatzsequenzierung identifizieren. Für die Hefe-tRNA-Endonuklease wurden solche nicht-kanonischen Aktivitäten für Boten-RNAs und ribosomale RNAs beschrieben. Unsere Daten werden zum ersten Mal eine direkte Beteiligung der menschlichen prä-tRNA-Endonuklease an zellulären Prozessen zeigen, die möglicherweise durch krankheitsverursachende Mutationen bedingt wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen