Brightness- and contrast-enhanced RNA hybridization probes for mRNA imaging and recognition of living cells
Final Report Abstract
Mit fluorogenen Oligonucleotid-Hybridisierungssonden können spezifische RNA-Moleküle in lebenden Zellen nachgewiesen/lokalisiert werden, ohne dabei die Zellen genetisch modifizieren zu müssen. Das Detektionslimit der derzeit verfügbaren Sonden reicht allerdings nicht aus, um RNA-Moleküle abzubilden/nachzuweisen, die in mittlerer geschweige denn niedriger Kopienzahl exprimiert werden. Wir entwickelten helligkeitsverstärkte RNA-Hybridisierungssonden (RNA-FIT-Sonden). Die RNA-FIT-Sonden enthalten ein fluoreszierendes Basensurrogat, das die Bindung der Sonde an das mRNA-Target durch verstärkte Fluoreszenzemission anzeigt. In einem Teil des Vorhabens entwickelten wir neue fluoreszente Basensurrogate, die heller fluoreszieren als die vormals bekannten Farbstoffe. Wir zeigten, dass ein im roten Spektralbereich emittierendes QB-Farbstoff-Nucleotid in der Lage ist, Einzelbasenveränderungen der mRNA in einer Zelle nachzuweisen. Eine Kombination aus zwei spektral unterscheidbarer FIT-Sonden wurde genutzt, um die Reifung von precursor-miRNA zu verfolgen. In einem weiteren Teil des Vorhabens wurden Multifluorophor-FIT-Sonden entwickelt. Wir zeigten, dass die Inkorporierung von zwei Basensurrogaten eine einfache Methode ist, Spezifität und Ansprechverhalten der FIT-Sonden zu verbessern. Jedoch begrenzte Selbstlöschung die maximale Helligkeit. Im dritten Teil des Vorhabens gelang es, das Kernproblem zu lösen und die ursprünglich als Fernziel veranschlagte Unterscheidung von T-Zell-Klonen anhand der TCR- mRNA zu realisieren. Zielführend war hier, die lichtsammelnden Hilfsfarbstoffe nicht wie vorgesehen direkt am fluoreszenten Basensurrogat anzubringen, sondern alkinmodifizierte Pyrimidinnucleotide zu nutzen. So konnte die Effizienz der Photonenabsorption durch Anbindung von zwei Lichtsammlern erhöht werden. Trotz der dadurch erzielten enormen Helligkeitssteigerung blieben die Sonden responsiv, weil ein nicht im Duplex interkaliertes QB-Basensurrogat die Fluoreszenz der Lichtsammler wirksam löschen kann. Auf der Basis dieses Prinzips konzipierten wir helligkeitsverstärkte RNA-FIT-Sonden, die eine hypervariable Region der mRNA für den T-Zellrezeptor (TCR) erkennen. Nach Mikroporation wurden T-Zelllinien fluoreszenzmikroskopisch und durchflußzytometrische untersucht. Die Sonden waren in der Lage, TCR-mRNA in lebenden, genetisch nicht modifizierten Zellen nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass es gelingen könnte, krebsreaktive T-Zell-Klone, die durch Sequenzierverfahren identifiziert wurden, mittels Durchflußzytometrie zu selektieren.
Publications
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Chemo-biological mRNA imaging with single nucleotide specificity. Chemical Communications, 55(98), 14817-14820.
Knoll, Andrea; Kankowski, Svenja; Schöllkopf, Sophie; Meier, Jochen C. & Seitz, Oliver
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Monitoring Dicer‐Mediated miRNA‐21 Maturation and Ago2 Loading by a Dual‐Colour FIT PNA Probe Set. ChemBioChem, 21(17), 2527-2532.
Loibl, Natalia; Arenz, Christoph & Seitz, Oliver
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Double FIT hybridization probes – towards enhancing brightness, turn-on and specificity of RNA detection. Chemical Science, 14(15), 4166-4173.
Schöllkopf, Sophie; Knoll, Andrea; Homer, Amal & Seitz, Oliver
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New Thiazole Orange Derivatives for Improved Fluorescence Signaling of DNA FIT Probes. Synthesis, 55(20), 3251-3262.
Seitz, Oliver & Homer, Amal
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Light-Harvesting FIT Probes for mRNA Detection in Live T Cells. American Chemical Society (ACS).
Homer, Amal; Knoll, Andrea; Gruber, Uschi & Seitz, Oliver
