Optimierung und Erprobung neuer Methoden zur Erzeugung von transgenen Zebrafinken
Biologie des Verhaltens und der Sinne
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Junge Singvögel, ähnlich wie menschliche Säuglinge beim Erlernen des Sprechens, erwerben ihre Lieder durch stimmliche Nachahmung erwachsener Artgenossen. Aufgrund dieser gemeinsamen Mechanismen werden Singvögel vielfach als Tiermodell für die Erforschung molekularer, neuronaler und physiologischer Aspekte des Lernens von vokaler Produktion verwendet. Allerdings können bisher Keimbahnveränderungen bei Singvögeln nicht zuverlässig und routinemäßig erzielt werden. Seit 2009 haben nur vier Labore erfolgreich transgene Zebrafinken erzeugt, was insgesamt sechs transgene Linien ergab. Die Effizienz bei der Erzeugung dieser Linien war gering und lag zwischen 1% und 10%. Die meisten transgenen Zebrafinken wurden durch die Injektion von Lentiviren in frisch gelegte Eier in Stufe X erzeugt, wobei primordiale Keimzellen (PGCs) als Zielzellen dienen. In einer Veröffentlichung aus dem Jahr 2020 wurden PGCs aus dem Blut von etwa 3 Tage alten Zebrafink-Embryonen extrahiert, kultiviert, mit einem Lentivirus infiziert, das ein ubiquitäres Promotor für das grün fluoreszierende Protein (GFP) enthielt, und in ein Embryo der Stufe X re-injiziert. Diese Methode zeigte eine gute Effizienz. Alle bestehenden Methoden zur Erzeugung transgener Zebrafinken beinhalten die Produktion einer chimären F0-Generation. Frühere Veröffentlichungen berichteten von einer geringen Effizienz (~13%) bei der Erzeugung transgener F1-Nachkommen, mit Ausnahme der Studie von 2020, die eine höhere Effizienz aufzeigte. Seit 1986 wurden mehrere verschiedene und effizientere Methoden zur Erzeugung transgener Hühner und Wachteln entwickelt. Daher schlugen wir vor, diese etablierten Methoden zu vergleichen und für die Erzeugung transgener Zebrafinklinien anzupassen. Im Zuge dieses Ziels haben wir fünf veröffentlichte Ansätze zur Erzeugung transgener Zebrafinken getestet, jedoch bisher ohne abschließenden Erfolg. 1) Die Injektion von Lentiviren in der Stufe X und in der Stufe 16-18 führte zu einer verbesserten Schlupfrate, aber ohne transgene Individuen; 2) Die Manipulation von Sperma mit assistierter Genbearbeitung (STAGE) führte zur Gewinnung, Aufrechterhaltung und künstlichen Befruchtung von Sperma, aber die Manipulation des Spermas war erfolglos; 3) Die invivo Elektroporation des Zebrafink-Hodens führte zu lang anhaltender Expression des reingebrachten Gens und fruchtbaren Männchen, aber keine Übertragung des Transgens auf die nächste Generation; 4) Die als hoch effizient bei der Erzeugung transgener Zebrafinken (Gessara et al., 2020) berichtete Methode konnte von uns nicht zur Produktion transgener F1-Nachkommen repliziert werden; 5) Die Kultivierung von PGCs, die aus den Gonaden von 6 Tage alten Zebrafinken extrahiert wurden, für drei Monate, was drei Mal länger ist als zuvor für Zebrafinken berichtet. Wir versuchen derzeit, diese kultivierten PGCs zu manipulieren. Die Modifikation des Genoms von Singvögeln bleibt ein Meilenstein, der erreicht werden muss, um das Potenzial dieser Spezies als Tiermodell für das Lernen der vokalen Produktion sowie für soziales und kognitives Verhalten voll auszuschöpfen. In den letzten drei Jahren haben wir bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung spezifischer Hindernisse und Lösungen gemacht, konnten jedoch noch keinen zuverlässigen Prozess etablieren.
