Ultrastruktur-Untersuchungen zur DNA-Replikation in Drosophila Polytän-Chromosomen mit Hilfe von Super-auflösender Mikroskopie

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Veit Schubert
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 429837513

• Erstellungsjahr: 2024

Zusammenfassung der Projektergebnisse

In diesem Projekt wollten wir die Ultrastruktur und Dynamik der DNA-Replikation in Polytänchromosomen von Drosophila mit Hilfe der räumlich superauflösenden strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) sichtbar machen. Wir untersuchten die räumlich-zeitliche Organisation der Replikation in verschiedenen individuellen Chromosomenregionen. Die Methoden wurden optimiert, um die Replikation nach EdU-Inkorporation und Immunmarkierung mit Antikörpern gegen das Replikationsgabelprotein PCNA abzubilden. Auf der Basis einer Drosophila-Linie, die das hsp70-CycE-Transgen trägt, wurde ein Ansatz entwickelt, um die S-Phase in Speicheldrüsenzellen innerhalb von maximal 20 Minuten zu induzieren. So konnten wir die Dynamik der Replikationsinitiierung während der frühen S-Phase analysieren. Die zuvor von Kolesnikova et al. (2018) aufgestellte Hypothese, dass die Initiierung der Replikation in polytenen Chromosomen in Intervallen erfolgt, wurde bestätigt, wobei sich herausstellte, dass sie probabilistisch ist. Darüber hinaus fanden wir Regionen, in denen die Replikationsinitiation sehr effizient in den ersten Minuten der S-Phase stattfindet, und Regionen, in denen sie nicht gleichzeitig auf verschiedenen DNA-Strängen auftritt, mit einer Zeitverschiebung von mehreren zehn Minuten. Wir haben ~40 sehr effiziente Orte für die frühe Replikationsinitiierung lokalisiert. Die meisten dieser Orte korrelieren mit den Loci Ecdyson-abhängiger Gene. Wir haben neue Ansätze zur Visualisierung transkriptionell aktiver Gene durch 3D-SIM entwickelt. Der gleichzeitige Nachweis von RNA-Polymerase II, die an Serin 5 und 2 phosphoryliert ist, was auf die Initiation bzw. Elongation der Transkription hinweist, ermöglichte es, lange Gene während ihres Transkriptionsverlaufs sichtbar zu machen. Auf diese Weise konnten wir auch die Richtung der Transkription sichtbar machen, insbesondere bei Genen, die sich in Puffs befinden. Zusätzlich zur klassischen Streifen-SIM verwendeten wir Lattice SIM², das mit dem verbesserten Mikroskopsystem Elyra 7 realisiert wurde und eine Auflösung von bis zu 60 nm erreicht. Damit konnten wir die doppelte Menge an RNA-Polymerase II Molekülen in transkriptionsaktiven Puffs nachweisen. Die Verteilung verschiedener Proteine und Histonmodifikationen wurde in Polytänchromosomen mittels 3D-SIM visualisiert. Die Auswirkungen von Mutationen im Rif1-Gen auf Morphologie, Unterreplikation und Replikationszeitpunkt im perizentromerischen Heterochromatin von polytenen Chromosomen von D. melanogaster wurden untersucht. Mittels 3D-SIM untersuchten wir die Organisation des Nukleolus, der in Rif1-Mutanten vollständig polytenisiert ist. Es wurden Protokolle und Software entwickelt, um die Replikation in räumlich erhaltenen Kernen von Speicheldrüsen zu analysieren. Dazu haben wir 3D-SIM zur Erkennung von Replikationsmarkierungen auf Halbdünnschnitten sowie die sequenzielle Untersuchung von Ultradünnschnitten mittels Licht- und Elektronenmikroskopie (Korrelationsmikroskopie) eingesetzt.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Ultrastructural investigation of early replication in Drosophila polytene chromosomes. Biopolymers and Cell, 35(3), 187-188.
  Kolesnikova, T. D.; Pokholkova, G. V.; Kolodyazhnaya, A. V. & Schubert, V.
  
• Effects of Mutations in the Drosophila melanogaster Rif1 Gene on the Replication and Underreplication of Pericentromeric Heterochromatin in Salivary Gland Polytene Chromosomes. Cells, 9(6), 1501.
  Kolesnikova, Tatyana D.; Kolodyazhnaya, Alexandra V.; Pokholkova, Galina V.; Schubert, Veit; Dovgan, Viktoria V.; Romanenko, Svetlana A.; Prokopov, Dmitry Yu. & Zhimulev, Igor F.
  
• Super-resolution microscopy reveals the early replication dynamics in Drosophila polytene chromosomes. International Conference “Drosophila in genetics and medicine”, St Petersburg – Gatchina, 30 September 2020
  Kolesnikova T.D., Pokholkova G.V., Kolodyazhnaya A.V., Dovgan V.V., Schubert V. & Zhimulev I.F.
  
• Structured illumination microscopy reveals the replication initiation dynamics in Drosophila polytene chromosomes. 62nd Annual Drosophila Research Conference, 23 March – 1 April 2021
  Kolesnikova T.D., Schubert V., Pokholkova G.V. & Dovgan V.V.
  
• A Spontaneous Inversion of the X Chromosome Heterochromatin Provides a Tool for Studying the Structure and Activity of the Nucleolus in Drosophila melanogaster. Cells, 11(23), 3872.
  Kolesnikova, Tatyana D.; Klenov, Mikhail S.; Nokhova, Alina R.; Lavrov, Sergey A.; Pokholkova, Galina V.; Schubert, Veit; Maltseva, Svetlana V.; Cook, Kevin R.; Dixon, Michael J. & Zhimulev, Igor F.
  
• Super-resolution microscopy reveals stochastic initiation of replication in Drosophila polytene chromosomes. Chromosome Research, 30(4), 361-383.
  Kolesnikova, Tatyana D.; Pokholkova, Galina V.; Dovgan, Viktoria V.; Zhimulev, Igor F. & Schubert, Veit
  
• Взаимосвязь между особенностями инициации репликации транскрипционной активностью в политенных хромосомах Drosophila melanogaster. III Объединенный научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов;Научные труды том 2, Сочи – Дагомыс, Russia 3–7 October 2022
  Kolesnikova T.D., Dovgan V.V., Pokholkova G.V. & Schubert V.
  
• Clusters of ecdysonedependent enhancers contain highly efficient early replication initiation sites in Drosophila polytene chromosomes. Cold Spring Harbor Conf. Sept 2023
  Kolesnikova T.D., Schubert V., Dovgan V.V. & Vorobyeva N.E.
  
• Drosophila polytene chromosomes as a tool for studying the probabilistic nature of replication initiation. Conference Chromosome 2023, Novosibirsk, Russia
  Kolesnikova T.D., Vorobyeva N.E., Dovgan V.V. & Schubert V.
  
• Сайты очень эффективной ранней инициации репликации в политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster связаны с кластерами экдизонзависимых энхансеров. Kонференция с международным участием „Дрозофила 2023“, St Petersburg – Gatchina, 3 – 6 October 2023
  Kolesnikova T.D., Vorobyeva N.E., Dovgan V.V., Pokholkova G.V. & Schubert V.
  
• Global nuclear reorganization during heterochromatin replication in the giant‐genome plant Nigella damascena L.. The Plant Journal, 120(4), 1508-1521.
  Arifulin, Eugene A.; Sorokin, Dmitry V.; Anoshina, Nadezhda A.; Kuznetsova, Maria A.; Valyaeva, Anna A.; Potashnikova, Daria M.; Omelchenko, Denis O.; Schubert, Veit; Kolesnikova, Tatyana D. & Sheval, Eugene V.