Eine genetisch kodierte ASAXS Methode zur Messung der Eigenschaften von Intrinsisch ungeordneten Proteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) verfügen über keine stabilen sekundären oder quartären Strukturen, sondern bilden stattdessen dynamische Ensembles aus wechselnden Konformationen. Eine Schlüssel-Eigenschaft dieser Ensembles ist ihr Skalierungsverhalten, das beschreibt, wie ihre Dimensionen mit der Anzahl der Aminosäurereste wachsen. Die Polymer-Theorie verknüpft den Skalierungsexponenten mit den dominierenden molekularen Wechselwirkungen – ob Selbst-Selbst- oder Selbst-Lösungsmittel-Wechselwirkungen überwiegen. Biologisch hilft das Skalierungsverhalten dabei, Proteinfunktionen vorherzusagen, einschließlich ihrer Beteili-gung an Phasentrennung und Aggregationsprozessen im Allgemeinen. Gängige experimentelle Techniken zur Untersuchung dieser Konformationen umfassen den Gyrationsradius (RG) aus der Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und die End-zu-End-Distanz (RE) aus der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Spektroskopie (FRET), insbesondere der Einzelmolekül-FRET (smFRET). Jedoch hat eine anhaltende Diskrepanz zwischen SAXS- und FRET-Ergeb-nissen erhebliche Debatten ausgelöst, die durch widersprüchliche hochrangige Veröffentlichungen verstärkt wurden. Diese Diskrepanz um diesen Ur-Parameter der Protein Struktur und Funktion lähmt den wissenschaftlichen Fortschritt im Feld der Protein Aggregation. Um diese Diskrepanz zu adressieren, haben wir ein genetisch kodiertes anomales SAXS (ASAXS)-Lineal eingeführt, das simultane und direkte Messungen von RG und RE ermöglicht, ohne ein spezifi-sches Strukturmodell vorauszusetzen. Dieses Lineal verwendet eine neuartige, selbstsyntheti-sierte nichtkanonische Aminosäure (ncAA) mit zwei Bromatomen, die anschließend genetisch mittels Amber-Suppression-Technologie kodiert wurde. Diese ncAA liefert ein anomalous Röntgenstreusignal für präzise Distanzmessungen. Durch diesen Ansatz zeigen wir experimen-tell, dass das Verhältnis zwischen RG und RE unter verschiedenen denaturierenden Bedingun-gen variiert. Dies unterstreicht, dass die intrinsischen Eigenschaften von IDPs die primäre Ur-sache für die beobachtete SAXS-FRET-Diskrepanz sind und nicht etwa Mängel in einer der beiden etablierten Methoden. Das entwickelte genetisch kodierte ASAXS-Lineal erweist sich als vielseitiges Werkzeug sowohl für IDPs als auch für gefaltete Proteine. Es bietet einen einheitlichen Ansatz zur Gewinnung von komplementären und positionsspezifischen konformationellen Informationen in Streuexperimenten und trägt somit zu einem tieferen Verständnis von Proteinfunktionen bei.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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A genetically encoded anomalous SAXS ruler to probe the dimensions of intrinsically disordered proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences, 121(50).
Yu, Miao; Gruzinov, Andrey Yu.; Ruan, Hao; Scheidt, Tom; Chowdhury, Aritra; Giofrè, Sabrina; Mohammed, Ahmed S. A.; Caria, Joana; Sauter, Paul F.; Svergun, Dmitri I. & Lemke, Edward A.
