Erforschung der wenig untersuchten CRISPR-Cas Verteidigungs-Systeme I-B und I-D in Haloarchaea
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In der ersten Hälfte dieses Projektes gab es mehrere "Überraschungen", die leider alle negativer Natur waren. Der Schwerpunkt der Arbeiten sollte in der Untersuchung des Typ I-D in H. lacusprofundi bestehen, im Laufe des Projektes stellte sich aber heraus, dass mit diesem Organismus nicht effektiv in vivo Arbeiten durchgeführt werden können. Auch die Arbeiten zur Adaptation wurden stark behindert durch die letztendlich erfolglose Suche nach Viren, die H. volcanii lysieren. Außerdem gab es in einigen Teil-Projekten entweder zeitgleiche Publikationen von kompetetierenden Arbeitsgruppen oder Probleme bei der Durchführung (z.B. Kristallisation des Typ I-D Cascade). In den beiden ersten Projektjahren waren die Arbeiten außerdem stark behindert von den Corona-Einschränkungen, bei denen die Labore zum Teil ganz gesperrt waren und dann längere Zeit nur im Schichtbetrieb genutzt werden konnten. Zusammenfassend haben wir trotz der aufgeführten Probleme und Rückschläge wichtige neue Erkenntnisse zum archaealen CRISPR-Cas Forschungsgebiet beitragen können. (i) Wir konnten nachweisen, dass es generell zu einem geringen Ausmaß naïve Adaptation in H. volcanii gibt. Wenn die Adaptationsproteine Cas1, Cas2, and Cas4 überexprimiert werden, wird diese naïve Adaptation verstärkt. (ii) Die im H. volcanii Genom integrierten Proviren reduzieren die Mobilität der Zellen und führen zu einer erhöhten Verteidigungsbereitschaft durch stärkere Expression der CRISPR-Cas Gene. Die Proviren können sich aus dem Genom rausschneiden und bilden intakte Viren, die im Überstand nachzuweisen sind. Erste Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Anwesenheit der Proviren auch Angriffe von weiteren Viren verhindert, somit als "superinfection exclusion" agiert. (iii) Das CRISPR-Cas Subtyp I-B aus H. volcanii stellt seine kleine Untereinheit Cas11 durch Expression aus dem cas8b Gen her. Ohne das Cas11 Protein werden weniger Cascade Komplexe hergestellt und die crRNA Konzentrationen sind deutlich geringer, woraus eine schwächere Verteidigungsaktivität resultiert. Das ist unseres Wissens das erste archaeale Protein, für das eine ORF-interne in-frame Translation gezeigt wurde. Außerdem ist es der erste Nachweis eines archaealen Cas11 Proteins. (iv) Mutanten des Cas7 Proteins haben gezeigt, welche Aminosäuren wichtig für die crRNA Stabilität und die Interferenz sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Adaptation induced by self-targeting in a type I-B CRISPR-Cas system. Journal of Biological Chemistry, 295(39), 13502-13515.
Stachler, Aris-Edda; Wörtz, Julia; Alkhnbashi, Omer S.; Turgeman-Grott, Israela; Smith, Rachel; Allers, Thorsten; Backofen, Rolf; Gophna, Uri & Marchfelder, Anita
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CRISPRi as an efficient tool for gene repression in archaea. Methods, 172, 76-85.
Stachler, Aris-Edda; Schwarz, Thandi Sarah; Schreiber, Sandra & Marchfelder, Anita
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Internal in-frame translation generates Cas11b, which is important for effective interference in an archaeal CRISPR-Cas system. openRxiv.
Sailer, A.-L.; Brendel, J.; Chernev, A.; König, S.; Bischler, T.; Gräfenhan, T.; Urlaub, H.; Gophna, U. & Marchfelder, A.
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Provirus deletion from Haloferax volcanii affects motility, stress resistance and CRISPR RNA expression. openRxiv.
Di Cianni, Nadia; Bolsinger, Simon; Brendel, Jutta; Raabe, Monika; König, Sabine; Mitchell, Laura; Bischler, Thorsten; Gräfenhan, Tom; Read, Clarissa; Erdmann, Susanne; Allers, Thorsten; Walther, Paul; Urlaub, Henning; Dyall-Smith, Mike; Pfeiffer, Friedhelm & Marchfelder, Anita
