Ribonukleotide und Chromatin - ein Genomik-Ansatz

• Antragstellerin: Dr. Vanessa Kellner
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 433825641

Der Einbau von Ribonukleotiden anstelle von Desoxyribonukleotiden durch DNA-Polymerasen ist ein häufiger Fehler bei der DNA-Replikation und führt zur Ansammlung von bis zu einer Million genomischer Ribonukleotidmonophosphate (rNMPs) pro humaner Zellteilung. Nicht reparierte rNMPs verursachen DNA-Replikationsstress und genomische Instabilität. Das konservierte RNase H2-Enzym initiiert die fehlerfreie Ribonukleotid-Exzisionsreparatur (RER), um das rNMP zu entfernen und den entstandenen Einzelstrang-Bruch zu versiegeln. RER-Mängel führen zu einer Anhäufung von genomischen rNMP. RNase-H2-Mutationen sind eine Ursache des Aicardi-Goutières-Syndroms (AGS), eine schwere autoinflammatorische und neurologische Störung. Außerdem verbinden neue Erkenntnisse einen Verlust der RNase-H2-Aktivität mit Krebs.RER ist mechanistisch gut definiert und scheint auf eine postreplikative Zellzyklus-Phase beschränkt zu sein, wenn DNA in Chromatin gepackt wird. Wie Chromatinstruktur die RER-Effizienz beeinflusst ist schlecht charakterisiert. Nukleosomen könnten die effiziente Reparatur stören, indem sie RNase H2 sterisch hindern. Zusätzlich wurde in vitro gezeigt, dass rNMPs sowohl DNA-Struktur als auch DNA-Protein-Interaktionen direkt beeinflussen. Daher sollten unreparierte rNMPs die Chromatinstruktur und die Zelltranskription in vivo beeinflussen. Wichtig ist, dass dies bisher vernachlässigte Faktoren sein könnten, die zur Pathologie von AGS und Krebs mit RNase-H2-Mangel beitragen. Frühere Arbeiten untersuchten hauptsächlich die gesamtheitliche Auswirkung des RNase H2-Verlusts und konzentrierten sich auf den direkten Effekt von rNMPs auf die Genomintegrität. Lokusspezifische Information und RER-Kinetiken während des Zellzyklus sind derzeit nicht verfügbar. Darüber hinaus müssen die Auswirkungen von Chromatin auf RER und von nicht reparierten rNMPs auf chromatinbezogene Prozesse wie Transkription und Nukleosomenassemblierung noch definiert werden.Ziel des vorgeschlagenen Forschungsprojekts ist es, die zeitliche und räumliche Regulation von RER genomweit aufzuklären. Zu diesem Zweck werde ich hydrolytische Endsequenzierung anwenden, eine von meinem Gastgeber mitentwickelte Tiefen-Sequenzierungsmethode, mit der rNMPs im Genom von Saccharomyces cerevisiae mit Einzel-Nukleotid-Auflösung kartiert werden können. Zunächst werde ich sowohl die Gesamtreparatureffizienz als auch die Lokus-spezifischen Unterschiede in RER während des Zellzyklus sowie den Einfluss von Chromatin auf RER bestimmen. Zweitens werde ich RNA-Seq- und In-vitro-assays anwenden, um den Effekt von unreparierten rNMPS auf Chromatinstruktur und Transkription zu untersuchen. Abschließend werde ich die molekulare Basis für transkriptionsabhängige Entfernung von rNMPs definieren, ein möglicher neuer Reparaturweg vorgeschlagen von unseren vorläufigen Daten.Zusammenfassend wird diese Arbeit den Zusammenhang zwischen Chromatin und RER aufklären und neue Einblicke in die Pathologie von AGS und Krebs liefern.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Duncan Smith, Ph.D.