Struktur-Funktionsanalyse der CC-Typ Glutaredoxine ROXY1 und ROXY9 aus Arabidopsis thaliana

• Antragstellerin: Professorin Dr. Christiane Gatz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 434032450

• Erstellungsjahr: 2025

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Nachdem wir ein Protokoll erstellt hatten, das die Expression und Reinigung eines Mitglieds der Familie der landpflanzenspezifischen Glutaredoxine (GRX) der Klasse III, in diesem Fall Arabidopsis thaliana ROXY9, ermöglicht, konnten wir der Frage nachgehen, ob ROXY9 die Funktionen der evolutionär älteren kanonischen GRX beibehalten hat. Diese spielen entweder als Oxidoreduktasen eine Rolle im anti-oxidativen Schutzsystem der Zelle (Klasse I) oder bei der Bindung von Eisen Schwefel Clustern (Klasse II). Im Gegensatz zu Klasse I GRX, ist ROXY9 als Oxidoreduktase inaktiv, wenn wir als Substrate glutathionylierte Modellsubstanzen wie bis(2-hydroxyethyl)disulfide (HED), glutathionyliertes Cystein und roGFP anbieten. Da ROXY9 physikalisch und genetisch mit dem TGACG-bindenden Transkriptionsfaktor TGA1 interagiert, haben wir auch TGA1 als Substrat angeboten. Allerdings konnte ROXY9 die Glutathionylierung von TGA1 nicht beschleunigen. Eine Voraussetzung für die enzymatische Aktivität von Klasse I GRX ist die reversible Glutathionylierung des ersten Cysteins im aktiven Zentrum. Diese erfolgt in ROXY9 nur unter stark oxidierenden Bedingungen, d.h. bei relativ hohen GSSG/GSH Verhältnissen. Im Gegensatz dazu werden GRX der Klasse I selbst bei hohen GSH/GSSG-Verhältnissen zu einem großen Anteil glutathionyliert. Somit erklären strukturelle Veränderungen in der Glutathion-Bindungsstelle, die zu einem veränderten Glutathion-Bindungsmodus führen, die enzymatische Inaktivität von ROXY9. Dies könnte sich entwickelt haben, um überlappende Funktionen mit Klasse I GRX zu vermeiden und wirft die Frage auf, ob ROXY9 TGA-Substrate durch Redoxmodifikation reguliert. Komplementationsexperimente mit einer ROXY9 Variante mit einem C/S-Austausch des putativen katalytisch aktiven Cysteins ergaben, dass dieses Cystein für die Funktion von ROXY9 als Aktivator der Expression von TGA1-regulierten Genen in der Wurzel nicht erforderlich ist. Unsere Analysen haben weiterhin die Dimerisierung von ROXY9 in Rekonstitutionsexperimenten zur FeS Clusterbindung unter anaeroben Bedingungen gezeigt. Allerdings ergaben unsere spektroskopischen Analysen keinen Aufschluss über die Identität des Clusters. Da die Cysteine des aktiven Zentrums für die in-vivo-Aktivität von ROXY9 nicht wichtig sind, ist es unwahrscheinlich, dass die Bindung eines FeS-Clusters für die Funktion von ROXY9 eine Rolle spielt.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Functional characterization of Arabidopsis thaliana CC-type glutaredoxin ROXY9. University Goettingen Repository.
  Mrozek, Pascal
  
• Molecular basis for the enzymatic inactivity of class III glutaredoxin ROXY9 on standard glutathionylated substrates. Nature Communications, 16(1).
  Mrozek, Pascal; Grunewald, Stephan; Treffon, Katrin; Poschmann, Gereon; Rabe von Pappenheim, Fabian; Tittmann, Kai & Gatz, Christiane
  
• Redox-inactive CC-type glutaredoxins interfere with TGA transcription factor–dependent repression of target promoters in roots. The Plant Cell, 37(3).
  Thurow, Corinna; Pelizaeus, Anja Maren; Mrozek, Pascal; Hoßbach, Ben Moritz; Budimir, Jelena; Schmitt, Kerstin; Valerius, Oliver; Braus, Gerhard & Gatz, Christiane