Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS): Verständnis der funktionellen Domänen-Interaktionen und der Direktionalität der Biosynthese mittels FRET-Spektroskopie

• Antragsteller: Professor Dr. Henning D. Mootz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 434700456

Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind große Enzyme, die als Templat für die Biosynthese von vielen wichtigen peptidischen Naturstoffen dienen, wie z.B. Daptomycin und Cyclosporin. NRPS sind aus repetitiven Modulen aufgebaut, wobei jedes Modul aus semi-autonomen Domänen besteht. Die Domänenzusammenstellung bestimmt die Struktur des Produktes, jedoch ist das Zusammenspiel zwischen den Adenylierungsdomänen (A-Domänen), Peptidyl-Carrier-Proteinen (PCP), Kondensationsdomänen (C), Thioesterasedomänen (TE) und weiteren Domänen wie der Epimerisierungsdomäne (E) nur unzureichend verstanden. Kristallstrukturen von NRPS-Multidomänen-Fragmenten zeigen wichtige statische Aufnahmen der molekularen Struktur von Domänen-Interaktionen und mögliche Konformationen. Allerdings gibt es nur ein stark limitiertes Verständnis von in Lösung angenommenen NRPS-Konformationen und der Änderung ihrer Dynamik im Zuge der Synthese. Unsere Gruppe hat diese Fragen in Pioneerarbeiten mittels FRET-Spektroskopie (Förster-Resonanz-Energietransfer) und komplementären Ansätzen verfolgt. Minimale NRPS-FRET-Sensoren wurden durch die Konjugation von Donor- und Akzeptor-Fluorophoren an interagierenden Domänen generiert. In der letzten Förderperiode haben wir neue Konformationen entdeckt und untersucht wie A- und C- sowie A- und E-Domänen um die Interaktion mit PCP konkurrieren. Aus dem dynamischen Konformationsgleichgewicht heraus haben wir dabei Änderungen in der Population verschiedener Konformationen nachgewiesen, die gemäß der synthetischen Logik sowohl zu erwarten als auch überraschend waren. Diese Erkenntnisse zeigen, dass das Konformationsverhalten auf noch unvorhersagbare Weise zu der Direktionalität und (optimierten) Prozessivität der NRP-Biosynthese beitragen kann. In der nächsten Förderperiode werden wir unsere Studien auf komplexere and ganzheitlichere NRPS-Systeme ausweiten, die alle Partnerdomänen eines PCP enthalten. Im Besonderen werden wir Konformationsänderungen untersuchen, die mit der Peptidbindungsbildung in den Initiations- und Elongationsschritten von Starter- und internen Modulen einhergehen. Wir werden die ersten dimodularen NRPS-FRET-Sensoren entwickeln, bei denen auch erstmalig Sensoren realisiert werden, die die PCP-Interaktion mit der stromabwärts agierenden C-Domäne abbilden. Weiterhin werden wir konformationelle Konsequenzen und mögliche konformationelle Sackgassen untersuchen, die sich aus künstlich maßgeschneiderten NRPS ergeben. Schließlich werden wir eine neue Protein-Markierungsstrategie mit FRET-Fluorophoren entwickeln, die auf der Erweiterung des genetischen Codes basiert und auf empfindliche Proteine angewendet werden kann, ohne dass deren native Cysteine zuvor entfernt werden müssen. Insgesamt werden die neuen Arbeiten die Proteintechnologien erweitern und neue Schlüsseleigenschaften der konformationellen Dynamik in NRPS ans Tageslicht bringen, die sowohl für die nativen NRPS als auch umprogrammierte Varianten von großer Wichtigkeit sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen