Translokation viraler DNA über die bakterielle Wirtsmembran.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bakteriophagen stehen bei der Infektion ihrer prokaryontischen Wirte alle vor dem Problem, dass sie ihre Erbinformation in die Bakterienzelle einbringen müssen, ohne dass der Phagenpartikel selbst in die Zelle aufgenommen wird. Es sind im Laufe der Evolution verschiedenste Mechanismen entwickelt worden, wie der Transport des großen Nukleinsäure-Makromoleküls in eine Bakterienzelle von statten gehen kann. Phagen mit kontraktilen Schwänzen wie zum Beispiel der T4 Phage setzen diesen hochverstilen Schwanz ein, um nach Art einer Injektionskanüle die Wirtszellwand zu durchdringen und die DNA über einen transienten Kanal in das Zytoplasma der Bakterienzelle zu transportieren. Kurzschwänzige Phagen wie T7 können dies nicht. Sie haben eine gänzlich andere Strategie entwickelt, ihre DNA in die Wirtszelle zu translozieren. Hierfür bringen sie einen komplexen Transportapparat, das Ejectosom (core Komplex) mit, der sich im Phagenkopf befindet und nach der Adsorption an die Wirtszelle aus dem Kapsid gelassen und in die Zellmembran eingebaut wird. Die molekularen Mechnismen, die hinter diesen Prozessen stehen sind noch nicht völlig aufgeklärt. Für den Phagen T7 standen strukturelle Untersuchungen des core Komplexes im Vordergrund des Projektes. Hierfür wurden die drei zentralen Untereinheiten gp14, gp15 und gp16 des Komplexes gereinigt und über SEC-MALS Messungen, Liposomenbindestudien sowie vorangegangene TEM-Aufnahmen von Subkomplexen analysiert. Es zeigte sich, dass kein strikter Assembly-Pathway vorliegt, sondern dass alle Untereinheiten in verschiedenen Stöchiometrien miteinander interagieren und dabei auch ihre Lipidbindeeigenschaften variieren. Detaillierte GFP- Lokalisationsstudien am putativen transmembranen gp16 Protein wiesen darauf hin, dass nur der hintere TMH2- Bereich des Proteins mit der Membran interagieren kann und TMH1 vermutlich keine transmembrane Topologie besitzt. Wir konnten zudem zeigen, dass das gp6.7 Protein eine an das Ejectosom assoziierte Untereinheit ist und zudem DNA-bindende Eigenschaften aufweist. Vermutlich ist daher gp6.7 am DNA-Transport beteiligt. Ebenso konnten wir für das bisher nur sehr unvollständig beschriebene, essentielle T7 Protein gp7.3 nachweisen, dass es, wiewohl in gereinigter Form ein lösliches, dimeres Protein, sowohl an Liposomen als auch an DNA bindet. Auch für dieses Protein vermuten wir daher eine aktive Rolle beim Ejectosom-Assembly und/oder beim DNA-Transport. Für diese beiden kleinen T7-Phagenproteine wurde bisher keine Funktion in diesen Prozessen beschrieben. Der Myophage T4 mit seinem kontraktilen Schwanz injiziert sein Erbgut über dieses hochflexible molekulare Instrument aus dem Phagenkapsid direkt in die Wirtszelle. Am korrekten Assembly dieses Instrumentes und einem effizienten DNA-Import wirken verschiedene Wirtsfaktoren in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellhülle mit. Wir konnten dabei eine Beteiligung sowohl löslicher periplasmatischer als auch membranständiger Wirtsproteine zeigen. Insbesondere die periplasmatische Isomerase PpiD konnten wir als funktionellen Interaktionspartner der gp5/5.4 Untereinheit des Phagen-Nadelkomplexes identifizieren, der mit für eine effiziente Phagenvermehrung sorgt. Einen noch größeren Einfluss hat die DamX-Untereinheit des Bakteriendivisoms. DamX bindet (vermutlich zusammen mit weiteren membranständigen Proteinen) an die gp27 Untereinheit der T4-Basisplatte. Dies konnten wir sowohl an gereinigten Komponenten als auch in vivo mit veränderten Phagen zeigen, die ein gp27-histag Protein trugen und bei der Infektion das DamX Protein der infizierten Zelle kontaktieren. Die Arbeiten zeigen, dass bei der Aufklärung des komplizierten molekularen Zusammenspiels von Phagen- und Wirtszellproteinen im Infektionsprozess weiterhin viele Fragen offen sind. Sie zeigen aber auch, dass mehr Augenmerk auf die Wirtsfaktoren insbesondere in der Zellhülle gelegt werden muss, da dieser erste Phagen- Wirtskontakt für eine effiziente DNA-Translokation und somit eine schnelle und wirksame Phagenvermehrung wichtig ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Involvement of the Cell Division Protein DamX in the Infection Process of Bacteriophage T4. Viruses, 16(4), 487.
Wenzel, Sabrina; Hess, Renate; Kiefer, Dorothee & Kuhn, Andreas
